本文選題：循環(huán)腫瘤細(xì)胞　切入點(diǎn)：端粒酶表達(dá)　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：腫瘤是危害人類(lèi)健康的嚴(yán)重疾病之一,雖然目前對(duì)于腫瘤的的治療已經(jīng)取得一定的進(jìn)展,但仍然有絕大多數(shù)腫瘤發(fā)展成為惡性腫瘤。由于缺乏有效的治療手段,一旦惡性腫瘤轉(zhuǎn)移,患者一般預(yù)后不良,生存率極低。因此,對(duì)腫瘤進(jìn)行有效地早期檢測(cè)將有助于降低惡性腫瘤的發(fā)生,從而提高患者生存率。血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)的檢測(cè)被認(rèn)為是一種非常有效的腫瘤的早期診斷方法,對(duì)后期診斷和治療具有重要意義。然而由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血液中極為稀少(通常只有1個(gè)CTC/105 107白細(xì)胞),現(xiàn)有的CTCs檢測(cè)及分離方法存在著專(zhuān)一性差,靈敏度低,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等缺陷而未能被廣泛開(kāi)發(fā)利用。本文依據(jù)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶h TERT(Human Telomerase Reverse Transcriptase)在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)而在正常體細(xì)胞中低表達(dá)的特性,以h TERT作為啟動(dòng)子構(gòu)建腺病毒,并結(jié)合一種快速過(guò)濾白細(xì)胞的新裝置FMSA(Flexible Micro Spring Array),從而對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行捕獲并感染,探索得到一種可以高效快速的捕獲活的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法,并通過(guò)少量患者及非患者血液樣本初步驗(yàn)證本研究所得方法的可行性,為后期運(yùn)用于臨床檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)�，F(xiàn)將本研究所得結(jié)果羅列如下:(1)構(gòu)建了四種重組腺病毒質(zhì)粒。用GFP標(biāo)簽替換pAdZ5的E3區(qū),構(gòu)建對(duì)照組質(zhì)粒pAd5G,其它三種質(zhì)粒分別在pAd5G的E1a的上游區(qū)域加入人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT的某些片段作為啟動(dòng)子,其中pAd5GTS包含一段450-bp hTERT的啟動(dòng)子,其可以在含有hTERT的細(xì)胞中表達(dá),pAd5GTL,包含一段1.4-kb hTERT啟動(dòng)子,加入了hTERT在正常細(xì)胞中表達(dá)的抑制元件,pAd5GTSe啟動(dòng)子部分除了和一段450-bp hTERT的啟動(dòng)子(和pAd5GTS相同)外,還添加了三個(gè)20bp的hTERT元件,該元件可以增強(qiáng)hTERT在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)而抑制其在人體正常細(xì)胞中的表達(dá)。這四種腺病毒通過(guò)HEK-293細(xì)胞包裝得到,并通過(guò)熒光觀察證明其可表達(dá)性。(2)本研究通過(guò)q RT-PCR和Microplate Reader檢測(cè)各細(xì)胞中hTERT表達(dá)量和GFP信號(hào)的關(guān)系,結(jié)果表明所有的重組腺病毒都可以在端粒酶高表達(dá)的細(xì)胞中更高效的復(fù)制,而對(duì)端粒酶低表達(dá)的細(xì)胞則侵染率很低,即可以用GFP熒光蛋白是否表達(dá)來(lái)區(qū)分腫瘤細(xì)胞與人體正常體細(xì)胞(因?yàn)槎肆Ｃ冈诩s85%以上的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),而在人體正常體細(xì)胞中則表達(dá)很低或者不表達(dá))。(3)篩選最佳腺病毒及其侵染的最佳濃度。通過(guò)不同濃度的腺病毒感染各種mCherry標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞,人體正常細(xì)胞,白細(xì)胞,確定最佳感染濃度為107PFU/ml,其后用重組腺病毒侵染(侵染濃度為107PFU/ml)腫瘤細(xì)胞/人體正常細(xì)胞與白細(xì)胞混合物,選出最佳腺病毒--Ad5GTSe,因?yàn)槠淇梢愿腥据^少白細(xì)胞的同時(shí)感染較多的腫瘤細(xì)胞,而感染的白細(xì)胞越少,檢測(cè)造成的假陽(yáng)性信號(hào)就越低,該研究所用腫瘤細(xì)胞/人體正常細(xì)胞為熒光蛋白mCherry標(biāo)記的細(xì)胞,使其易于和白細(xì)胞分辨,從而提高研究準(zhǔn)確度。(4)初步檢驗(yàn)本文所得檢測(cè)方法的可行性。將FMSA過(guò)濾裝置與選擇性腺病毒相結(jié)合運(yùn)用于少量患者新鮮血液樣本檢測(cè),初步驗(yàn)證本研究所得檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTCs方法的有效性。首先,我們檢測(cè)了FMSA過(guò)濾裝置的可行性,通過(guò)將mCherry標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞人為加入到正常人血液中,經(jīng)由FMSA過(guò)濾裝置后,85%以上的腫瘤細(xì)胞及少量白細(xì)胞(約為103~5個(gè))被捕獲在濾膜上,利用最佳腺病毒Ad5GTSe感染濾膜上的細(xì)胞,24小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察,數(shù)據(jù)顯示該方法同體外單獨(dú)感染腫瘤細(xì)胞與白細(xì)胞混合物的感染率一致,證明該裝置可行。研究進(jìn)一步將該檢測(cè)方法運(yùn)用于少量已知腫瘤類(lèi)型的患者血液樣本,并與CellSearch對(duì)比,結(jié)果初步證明這種將二者結(jié)合的方法對(duì)于檢測(cè)新鮮血液樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞可行。以上結(jié)果表明,本研究探索到一種高效快捷的捕獲及檢測(cè)血液中活的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法:即將FMSA過(guò)濾裝置與帶有h TERT啟動(dòng)子的選擇性腺病毒相結(jié)合。經(jīng)患者新鮮血液樣本的初步實(shí)驗(yàn)表明,該方法操作簡(jiǎn)單,對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別專(zhuān)一性強(qiáng),為后期惡性腫瘤的早期診斷提供了一種初步檢測(cè)方法。但對(duì)于臨床檢測(cè)的準(zhǔn)確性,仍然需要進(jìn)一步加大血液樣本進(jìn)行驗(yàn)證。
[Abstract]:鑲跨槫鏄嵄瀹充漢綾誨仴搴風(fēng)殑涓ラ噸鐤劇梾涔嬩竴,铏界劧鐩墠瀵逛簬鑲跨槫鐨勭殑娌葷枟宸茬粡鍙栧緱涓，

本文編號(hào)：1698280