本文選題：膠質(zhì)瘤　切入點：外泌體　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)標志,也是導(dǎo)致腫瘤治療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因之一。高度侵襲性是惡性膠質(zhì)瘤的重要病理學(xué)特征,瘤體邊界不清致使手術(shù)完整切除難度增大,從而導(dǎo)致腫瘤很快復(fù)發(fā),這是患者預(yù)后差,復(fù)發(fā)率、死亡率高的主要原因。腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤,國內(nèi)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生率占顱內(nèi)腫瘤的35%~60%,5年生存率僅為20%~30%,是神經(jīng)外科臨床工作中面臨的最嚴重的腫瘤之一。對腦膠質(zhì)瘤的治療措施,傳統(tǒng)上仍然以手術(shù)為最重要的手段,但由于膠質(zhì)瘤多為浸潤型生長,單純的手術(shù)治療后,很容易復(fù)發(fā),療效并不能使人滿意。由于腫瘤細胞存在放療抗拒,術(shù)后放療尚不能殺滅殘余的腫瘤細胞,因此研究腫瘤細胞是通過怎樣的機制逃避放療的殺傷和如何降低此種機制的作用,對提高放療在膠質(zhì)瘤治療中的療效有很大的必要性。腫瘤細胞的免疫逃避是指其通過多種方式逃避機體的免疫識別和攻擊,例如:細胞表面標志物的改變,包括腫瘤細胞表面的MHCⅠ類分子表達下降或者缺失、腫瘤抗原的變異、FAS系統(tǒng)的作用、B7分子的表達異常等。腫瘤來源的免疫抑制因子:如IL-10、VEGF、TGF-β等,其可以影響DC細胞及T細胞的成熟活化。腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)T細胞功能障礙,其中主要是通過受體/配體結(jié)合的方式釋放抑制性的信號,降低T細胞的功能。T細胞功能的障礙,會導(dǎo)致機體免疫減弱。PIGF在癌變的情況下會引起高表達,同時它的相關(guān)受體VEGFR1的表達也會提高。PIGF在多種腫瘤中明顯上升,可以作為某些癌癥的指標性物質(zhì)。PIGF不僅可以刺激血管源細胞形成新血管,而且PIGF可以直接作用于腫瘤細胞,損傷DC細胞,從而促進腫瘤的生長,也可以刺激骨髓中血管生成祖細胞轉(zhuǎn)移向腫瘤病灶。加入PIGF抗體在體內(nèi)不僅可以阻止新血管的生成,還可以刺激已生成血管的退化。最近研究報道顯示PlGF也參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病理和免疫調(diào)節(jié)過程。我們假設(shè)膠質(zhì)瘤分泌的PlGF通過外泌體作用于膠質(zhì)瘤病灶微環(huán)境中的B細胞,使B細胞能夠表達TGF-β,轉(zhuǎn)化為TGF-β(+)的Bregs細胞,Bregs細胞可以特異性的抑制膠質(zhì)瘤患者CD8(+)T細胞的增殖和活性,從而膠質(zhì)瘤細胞逃避免疫監(jiān)視向正常組織侵襲擴散。通過本研究證明:1從膠質(zhì)瘤組織中分離純化的惡性膠質(zhì)瘤細胞(whoⅢ~Ⅳ級)在體外培養(yǎng)后,細胞內(nèi)plgfmrna和蛋白有表達,當(dāng)用不同濃度的pma刺激后plgf隨其濃度增加而增加。表明惡性膠質(zhì)瘤細胞中有plgf表達。2密度梯度離心分離膠質(zhì)瘤細胞上清中的外泌體,lamp-1特異性驗證外泌體后,裂解外泌體后可檢測出plgf蛋白,表明膠質(zhì)瘤細胞可以表達plgf,并且其外泌體中也含有plgf蛋白3正常人全血中分離獲得na?veb細胞(cd19+il-7r+cd45+),將收集的膠質(zhì)瘤外泌體用csfe標記后與na?veb細胞共培養(yǎng),免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)na?veb細胞可以捕獲膠質(zhì)瘤外泌體;進一步將捕獲膠質(zhì)瘤外泌體的na?veb細胞,用單價plgf和其抑制劑的na?veb細胞為對照,結(jié)果顯示:不同濃度外泌體刺激的b細胞隨外泌體濃度的升高tgf-βmrna和蛋白都增高,單加plgf也可使na?veb細胞表達tgf-β增加。表明攜帶plgf的膠質(zhì)瘤外泌體可以被naiveb細胞捕獲,捕獲后的na?veb細胞可特異表達tgf-β,且與plgf調(diào)控有關(guān);即攜帶plgf的外泌體可以將膠質(zhì)瘤病灶微環(huán)境中na?veb細胞轉(zhuǎn)化為tgf-β(+)bregs細胞。4將膠質(zhì)瘤組織中分離的b細胞、膠質(zhì)瘤患者外周血中的b細胞以及刺激轉(zhuǎn)化的tgf-β(+)bregs細胞分別用csfe標記,提取膠質(zhì)瘤組織內(nèi)含物,10mg/ml的膠質(zhì)瘤組織提取物分別刺激三種獲得的b細胞,以10mg/mlbsa為陰性對照,5%co237℃孵箱培養(yǎng)3天后流式檢測三種b細胞增殖程度,結(jié)果表明:91.2%的組織來源b細胞增殖和8.14%的外周血b細胞增殖,約有60.8%的bregs細胞得到增殖,結(jié)果顯示增殖的b細胞具有膠質(zhì)瘤特異性,膠質(zhì)瘤特異性bregs細胞可能存在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤患者的外周循環(huán)系統(tǒng)中5從膠質(zhì)瘤患者全血中密度梯度離心分離pbmc后,接種75cm細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2h后,將貼壁細胞與非貼壁細胞分開培養(yǎng),加入不同細胞刺激因子培養(yǎng)7天獲得dc細胞和t細胞,再采用磁珠法分離純化cd8(+)cd25(-)t細胞。將獲得的cd8(+)cd25(-)t細胞用csfe標記后,按30萬:20萬比例與dc細胞混合接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,10mg/ml膠質(zhì)瘤組織提取物,陰性對照加入10mg/mlbsa,然后加入20萬誘導(dǎo)bregs細胞、naiveb細胞以及誘導(dǎo)bregs細胞先與膠質(zhì)瘤提取物培養(yǎng)后刺激3天,不加b細胞為對照。結(jié)果顯示:,流式細胞結(jié)果以csfe標記細胞設(shè)門,bsa刺激的cd8+t細胞增殖2.18%,膠質(zhì)瘤提取物刺激的cd8+t細胞增殖23.0%,提示其中有一部分為膠質(zhì)瘤特異性cd8+t細胞擴增;膠質(zhì)瘤特異性CD8+T細胞可被膠質(zhì)瘤特異性誘導(dǎo)Bregs細胞抑制活性,CD8+T細胞增殖為2.11%,天然B細胞則不能抑制CD8+T細胞增殖為30.2%。誘導(dǎo)Bregs細胞與T/DC細胞相同條件分開培養(yǎng)后再混合也可以抑制,CD8+T細胞增殖3.33%。膠質(zhì)瘤提取物培養(yǎng)刺激膠質(zhì)瘤患者CD8+T細胞可以分泌顆粒酶B和穿孔素,當(dāng)Bregs細胞存在時也可以抑制其分泌。表明攜帶PlGF外泌體誘導(dǎo)的TGF-β(+)Bregs細胞具有特異性抑制膠質(zhì)瘤CD8(+)T細胞增殖,同時穿孔素與顆粒酶B檢測結(jié)果顯示Bregs細胞也可抑制CD8(+)T細胞的殺傷活性�？傊�,在惡性膠質(zhì)瘤細胞中異常表達的Pl GF,通過細胞外泌體攜帶PlGF被膠質(zhì)瘤病灶周圍的Naive B細胞捕獲,使腫瘤微環(huán)境的Naive B細胞轉(zhuǎn)變?yōu)門GF-β(+)Bregs細胞,該Bregs細胞具有膠質(zhì)瘤特異性,可以抑制特異性膠質(zhì)瘤CD8(+)T增殖和活性,可能是膠質(zhì)瘤細胞逃避免疫監(jiān)視侵襲正常組織的機制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：1698110