發(fā)布時間：2018-04-01 10:25

  本文選題：膠質(zhì)瘤　切入點：Let-7f　出處：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景人腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,可占全部顱內(nèi)腫瘤的60%左右。腫瘤呈浸潤性生長,手術(shù)難以徹底切除,治療效果差,死亡率高�，F(xiàn)階段治療除手術(shù)切除外,又結(jié)合了放療、化療等綜合治療措施,膠質(zhì)瘤的致死率略微下降,但是由于其具有高度的侵襲及增殖能力,整體的預后仍不理想,5年死亡率超過95%。膠質(zhì)瘤的治療一直是神經(jīng)外科醫(yī)師治療神經(jīng)腫瘤疾病所面臨的難題。作為一種多基因異常疾病,膠質(zhì)瘤的發(fā)病原因為抑癌基因失活、原癌基因激活所引發(fā)的諸多基因異常問題,以及這些問題的動態(tài)發(fā)展。所以,對于膠質(zhì)瘤發(fā)生機制的研究及診斷、治療來說,通過免疫組織化學、分子生物學等技術(shù)手段,對相關(guān)蛋白水平、基因的變化差異進行分析,具有不容忽視的意義。miRNA是一類進化上非常保守、長度約18～25個核苷酸大小的非編碼調(diào)控小分子RNA。通過特異性結(jié)合靶基因3'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域,能夠抑制靶nRNA的翻譯,或借助降解靶mRNA的方式,完成轉(zhuǎn)錄、調(diào)控基因的任務。據(jù)統(tǒng)計,miRNA所調(diào)控的基因,在人類基因組中的占比約為三成,相關(guān)研究成果表明,該分子參與調(diào)節(jié)多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展,發(fā)揮”癌基因”或”抑癌基因”的功能。異常表達的miRNAS普遍存在于膠質(zhì)瘤細胞中,對腫瘤發(fā)生、演進等帶來不同程度的影響。miRNA的種類較多,Let-7家族是目前研究最廣泛的miRNA之一。Let-7家族共包括13個成員,Let-7f是家族成員之一,位于9q22.3。目前研究發(fā)現(xiàn),Let-7f在不同的腫瘤中表達是不同的。在大多數(shù)腫瘤如卵巢癌、肺癌、胃癌中表達下調(diào),而在乳腺癌和肝癌中的表達上調(diào),Let-7f的異常表達可能在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。目前,在膠質(zhì)瘤方面的研究尚處于起步階段,雖已有研究報道Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響,但Let-7f有許多靶基因,它們與Let-7f共同組成一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡,不同靶基因以不同的信號通路參與Let-7f對腫瘤細胞生長的調(diào)控,所以具體機制仍需進一步研究。miRNA不但存在于腦組織中,亦存在于血清及腦脊液樣本中。在癌癥的診斷過程中,作為一種可操作性較強的潛在標志物,miRNA在體液中具有較為穩(wěn)定的表達,同時還表現(xiàn)出低損傷性、高靈敏度、檢測難度小等特點。已有文獻報道,應用血液中miRNA的含量的變化早期診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤,如miRNA-205, miRNA-128和miRNA-210等。這些生物標志物的敏感度和特異度各不相同,仍存在諸多不足,迄今為止尚沒有一種能得到國內(nèi)外學者公認的可以通過血清穩(wěn)定檢測到的miRNA臨床應用于膠質(zhì)瘤的早期診斷和預后評估。對于Let-7f在實體腫瘤中表達的臨床意義及在預后判斷方面的價值目前研究不多,為了觀察Let-7f在膠質(zhì)瘤患者中的表達情況并進一步探討對于早期診斷和預后評估可能發(fā)揮的作用,我們檢測了膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織與正常腦組織、血清與健康對照者血清Let-7f表達水平差異,并結(jié)合患者臨床數(shù)據(jù)、組織病理學特征、術(shù)后生存時間等對其在膠質(zhì)瘤患者預后評估和早期診斷的價值進行了分析。為了探討Let-7f調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞增殖的作用機制,我們檢測了Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞系與正常星形細胞系中的表達差異,以及Let-7f對體外膠質(zhì)瘤細胞生長增殖能力的影響。找出并驗證RAB40C為Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞中的目標靶基因,并對其在細胞增殖方面的調(diào)節(jié)作用機制進行初步探究,以期對Let-7f表達水平的臨床意義及膠質(zhì)瘤的分子靶向治療提供理論基礎(chǔ)支持。本課題實驗分為以下兩部分：第一部分：Let-7f在膠質(zhì)瘤中的表達及其與臨床的相關(guān)性研究目的：檢測Let-7f在膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及血清中的表達水平；探討Let-7f表達水平與患者臨床特征之間的關(guān)系及對預后判斷及早期診斷的意義。方法：1、通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測108例膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及瘤旁非瘤性正常腦組織樣本中Let-7f的表達情況；檢測108例膠質(zhì)瘤患者及40例健康對照者血清中Let-7f的表達情況。2、分析膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中Let-7f表達水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、部位、病理級別及術(shù)前KPS評分等臨床特點的相關(guān)性。3、以Kaplan-Meier生存分析方法研究獲得完整隨訪資料的101例膠質(zhì)瘤患者中腫瘤組織Let-7f表達水平與患者術(shù)后生存時間的相關(guān)性。4、以單因素及多因素Cox比例風險回歸模型分析膠質(zhì)瘤患者的性別、年齡、腫瘤大小、部位、病理級別、KPS評分、Le-7f表達水平,尋找影響膠質(zhì)瘤患者預后的獨立危險因素。5、分析不同級別和組別的膠質(zhì)瘤患者血清Le-7f表達水平的差異。通過ROC曲線及ROC曲線下面積(AUC)來評估血清Let-7f表達水平對不同病理級別膠質(zhì)瘤的早期診斷價值。結(jié)果：1、Let-7f在膠質(zhì)瘤組織及血液中均呈低表達。108例膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織樣本中Le-7f的表達水平明顯低于正常腦組織(0.45±0.203 VS 1.09±0.211),兩者間有顯著統(tǒng)計學差異(P=0.000);膠質(zhì)瘤患者血清中Let-7f表達水平較40例健康對照者血清有明顯降低(0.39±0.201 VS0.88±0.260 P0.001)。Le-7f在膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及其對應的血清樣本中的表達水平具有相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)R2=0.853(P=0.01)。2、膠質(zhì)瘤組織中Let-7f的表達與腫瘤大小、WHO分級顯著相關(guān)。膠質(zhì)瘤組織中Let-7f的表達水平在不同腫瘤大小和不同病理級別患者中有顯著差異,而與其它因素無明顯相關(guān)性。以Le-7f的平均表達水平(0.51)為界,所有患者分為高、低水平表達兩組。70.6%的WHO分級ⅢI～Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者進入低水平表達組；而Ⅰ-Ⅱ級患者中,Let-7f的表達水平低于均值的僅有35.1%,差異顯著(χ2=13.588 P=0.001)。不同WHO分級的兩組患者Let-7f平均表達水平者有顯著差異(0.33±0.191 VS 0.79±0.20 P0.001)。腫瘤直徑在3cm以上的膠質(zhì)瘤患者Le-7f低表達比例及Let-7f平均表達水平與腫瘤直徑在3cm以下患者有顯著差異(χ2=8.306 P=0.004；0.38±0.193 VS 0.69±0.198 P0.01)。3、膠質(zhì)瘤組織中Let-7f的表達水平越低,患者術(shù)后生存時間越短。Kaplan-Meier生存分析方法顯示：獲得完整隨訪資料的101例膠質(zhì)瘤患者中腫瘤組織Let-7f呈低表達水平的患者術(shù)后生存時間明顯短于高表達組患者(24.1 month VS 34.5 month), Log rank檢驗顯示兩組有顯著性差異(P=0.000)。47例WHO分級m～Ⅳ級患者中,Le-7f低表達組的患者術(shù)后中位生存時間與高表達組患者差異顯著(13.2month VS 24.5 month P0.001)。而在54例Ⅰ～Ⅱ級患者中,Let-7f低表達組患者的術(shù)后中位生存時間與高表達組患者并無顯著性差異(37.3month VS 41.7 month P0.05)。4、Let-7f是影響膠質(zhì)瘤患者預后的獨立危險因素。單因素分析檢驗結(jié)果顯示,KPS評分80分、WHO分級增高和腫瘤組織中Let-7f低表達均是影響膠質(zhì)瘤患者預后的因素。運用單變量和多變量Cox比例風險回歸模型分析結(jié)果顯示,KPS評分、WHO分級和腫瘤組織中Let-7f表達水平均是影響膠質(zhì)瘤患者預后的獨立因素指標。KPS評分越低、WHO分級越高和以及腫瘤組織中Let-7f表達水平越低,則患者的預后越差。顯示Let-7f的表達與預后顯著相關(guān),是影響膠質(zhì)瘤患者預后的獨立危險因素(HR=1.971,95%CI=1.381-2.813,P=0.000)。5、.膠質(zhì)瘤患者血清Let-7f表達水平對惡性膠質(zhì)瘤早期診斷具有一定意義。膠質(zhì)瘤患者的血清Let-7f表達水平與WHO分級密切相關(guān)(P0.001)。所有級別膠質(zhì)瘤的AUC為0.719(95% CI,0.653-0.828)。血清Let-7f的臨界值為1.50,相應的敏感度和特異度分別為53.6%和82.1%。高級別膠質(zhì)瘤AUC為0.795(95% CI,0.688-0.901),提示Le-7f對惡性膠質(zhì)瘤早期診斷具有一定意義。結(jié)論：膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及血液中Let-7f均呈現(xiàn)低表達。Let-7f可作為一種新的腫瘤標志物,對判定膠質(zhì)瘤惡性程度和預后分析帶來幫助,并對惡性膠質(zhì)瘤具有一定的早期診斷價值。第二部分：Let-7f通過靶基因RAB40C抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖的機制研究目的：檢測Let-7f在人膠質(zhì)瘤細胞系和正常星形細胞中的表達情況；尋找并驗證Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞中的下游靶基因,探討Let-7f通過靶基因調(diào)控膠質(zhì)瘤增殖的作用機制。方法：1、應用RT-qPCR方法檢測Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞系U251、SHG-44、A172、U138、T98G和正常星型細胞中的的表達水平。2、通過Lipofectamine2000瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將Let-7fmimics、Let-7finhibitor分別轉(zhuǎn)染入A172、T98G。qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。CCK-8法進行細胞增殖實驗,以細胞轉(zhuǎn)染作為時間節(jié)點,檢測時間分別為細胞生長的第24、48、72、96小時。流式細胞儀檢測細胞生長周期變化。3、檢索miRBase、Targetscan、microRNAs等數(shù)據(jù)庫,尋找Le-7f的目標靶基因。運用RT-PCR和Western blot技術(shù)分別對轉(zhuǎn)染細胞進行檢測,研究抑制和過表達Let-7f對靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的影響。應用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證尋找到的靶基因是否為Let-7f的下游目標靶基因。4、分別干擾和過表達Le-7f及靶基因RAB40C,并分為4組進行比較：A組：control、siRNA-Let-7f, si-RAB40C、siRNA-Let-7f+si-RAB40C; B組:control, Let-7finimics、pEGFP-C1-RAB40C、Let-7fmimics+pEGFP-C1-RAB40C; C組: control、siRNA-Let-7f、pEGFP-C1-RAB40C、siRNA-Let-7f+ pEGFP-C1-RAB40C; D組:control、Let-7fmimics、si-RAB40C、Let-7finimics+si-RAB40C。采用 CCK-8法對轉(zhuǎn)染細胞進行增殖能力檢測,通過比較分析Le-7f及其靶基因RAB40C在膠質(zhì)瘤細胞增殖活動中的分子作用機制。結(jié)果：1、Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞系中表達下調(diào)Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞系U251、SHG-44、A172、U138、T98G中的表達水平明顯低于正常星型細胞中的的表達(P0.01),選擇表達最低的A172、T98G進行進一步的實驗研究。2、Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖Lipofectamine2000瞬時轉(zhuǎn)染法成功將Let-7fmimics、Let-7finhibitor轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤細胞A172、T98G、qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率滿意。轉(zhuǎn)染Let-7fmimics后細胞增殖能力比轉(zhuǎn)染Let-7finimicsNC或未轉(zhuǎn)染組明顯降低,流式細胞儀檢測顯示GO期細胞比例增加,S期細胞比例減少；而轉(zhuǎn)染Let-7finhibitor后細胞的增殖能力顯著升高,流式細胞儀檢測顯示GO期細胞比例降低,S期細胞比例升高。差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。3、Le-7f功能靶基因為RAB40C搜索數(shù)據(jù)庫結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAB40 C的3'UTR與Let-7f存在潛在的結(jié)合位點。膠質(zhì)瘤細胞系轉(zhuǎn)染Let-7finimics、Let-7finhibitor結(jié)果顯示：相比于未轉(zhuǎn)染組、Let-7finimicsNC組,Let-7finimics組的RAB40C表達水平降幅明顯(P0.001)。雙熒光素酶報告基因活性檢測結(jié)果表明,共轉(zhuǎn)染野生型RAB40C表達載體與Let-7finimics后,熒光素酶相對活性明顯下降(P0.01)；而共轉(zhuǎn)染野生型AB40C表達載體與Let-7finhibitor后,熒光素酶相對活性升高(P0.01)。在突變型RAB40C表達載體與Let-7finimics 和 Let-7finhibitor共轉(zhuǎn)染體系中均未檢測到熒光素酶相對活性有明顯改變。4、RAB40C參與Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞增殖的調(diào)控結(jié)果顯示siRNA-Let-7f, pEGFP-C1-RAB40C細胞增殖能力增強(P0.01)；Let-7finimics、si-RAB40C細胞增殖能力降低(P0.01)siRNA-Let-7f+si-RAB40C、let-7mimics + pEGFP-C1-RAB40C細胞增殖變化不明顯;siRNA-Let-7f+ pEGFP-C1-RAB40C細胞增殖能力顯著增強(P0.001)；Let-7finimics+si-RAB40C細胞增殖能力顯著降低(P0.001)。表明過表達Let-7f抑制的膠質(zhì)瘤細胞增殖可被過表達的RAB40C拮抗。證實Let-7f是通過特異性結(jié)合RAB40C對其進行負性調(diào)節(jié),減少RAB40C基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達,從而起到抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖的作用。結(jié)論：RAB40C是Let-7f的功能靶基因,Let-7f通過對RAB40C的負性調(diào)節(jié)抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖,對Let-7f及其靶基因RAB40C的表達進行調(diào)控可能為膠質(zhì)瘤的治療提供一種新的有效途徑。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 韓戰(zhàn)栓;陳素娟;王紅濤;;腦膠質(zhì)瘤術(shù)后預后的Cox比例風險分析[J];中華實用診斷與治療雜志;2009年05期

，

本文編號：1695176