本文選題：喉癌　切入點：表皮生長因子受體　出處：《浙江大學》2015年博士論文

【摘要】：研究背景和目的： 喉癌是上呼吸道常見惡性腫瘤。喉癌患者的生存率并未隨著近三十年來醫(yī)療技術(shù)的進步而明顯改善。部分晚期喉癌患者失去了根治性手術(shù)的機會,治療需要依靠放化療,該部分患者生存率較低。因此,應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學技術(shù),探討高效低毒的喉癌治療新方法具有臨床實際意義�；蛑委熥鳛樯镏委煹闹匾M成部分,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的研究,它能否為喉癌的治療帶來了新的希望值得研究探討。 腺病毒是基因治療中常用的基因載體,通過腫瘤特異性啟動子調(diào)控目的基因的表達,可以實現(xiàn)重組腺病毒對腫瘤組織的靶向性。在前期的研究中,我們證實了分泌性白細胞蛋白酶抑制因子(Secretory Leukoprotease Inhibitor, SLPI)啟動子調(diào)控的重組腺病毒具有良好的喉癌組織靶向性。 細胞的增殖失控和凋亡受阻共同促成惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此腫瘤基因治療可以從抑制細胞增殖和促進細胞凋亡兩方面著手。表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)在頭頸部鱗狀細胞癌(Head and Neck Squamous CellCarcinoma, HNSCC)中過度表達,是其惡性表現(xiàn)的重要分子機制之一,與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及疾病預(yù)后關(guān)系密切。EGFR是近年來HNSCC生物治療的熱門靶點。分子靶向藥物易因EGFR過表達、降解障礙和靶點突變等原因?qū)е履退帯Ｍㄟ^RNA干擾技術(shù)可以下調(diào)EGFR的表達從而抑制腫瘤細胞增殖,并可避免上述耐藥現(xiàn)象。 天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)在細胞凋亡信號傳遞中居核心地位。重組活化型Caspase-3(revCasp3)是由人體天然Caspase-3經(jīng)人工重組而來,它不需上游分子的切割活化就能自發(fā)折疊成活性狀態(tài),直接誘導細胞凋亡。前期研究發(fā)現(xiàn),用SLPI啟動子調(diào)控重組活化型Caspase-3在喉癌細胞中表達能夠特異性有效抑制喉癌。 本文設(shè)計以重組腺病毒為載體,用喉癌特異性的SLPI啟動子調(diào)控以EGFR為靶點的人工nicroRNA和重組活化型Caspase-3,與臨床一線藥物順鉑(DDP)和西妥昔單抗(Cetuximab)相比較,研究該重組腺病毒對人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2的體、內(nèi)外抑制作用,探討該雙向途經(jīng)基因治療策略抑制喉癌的效果。 方法： 1.構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA-SLPI-revCasp3-TAG-pA和pDC312-SLPI-GFP-pA,分別與骨架質(zhì)粒pBGHlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細胞進行腺病毒包裝。PCR鑒定重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR-SLPI-revCasp3(簡寫為Ad-EC),和Ad-SLPI-GFP (簡寫為Ad-GFP)。擴增病毒,CsCl密度梯度離心法純化病毒,TCID50法測定病毒滴度。病毒分別感染Hep-2細胞和人正常成纖維細胞(Normal Fibroblast, NF),用熒光顯微鏡、流式細胞儀和Western blot檢測目的基因的表達。 2.將Ad-EC、Ad-GFP、DDP、Cetuximab以及Ad-EC+DDP合用分別作用于Hep-2,用MTT,流式細胞儀和iCELLigence實時無標記動態(tài)細胞分析技術(shù)(Real TimeCellular Analysis, RTCA)檢測Hep-2細胞的增殖和凋亡,用、Vestern blot檢測相關(guān)蛋白的表達水平。 3.建立喉癌荷瘤裸鼠模型,分為Ad-EC、Ad-GFP、DDP、Cetuximab、Ad-EC+DDP以及PBS六個處理組,比較用藥過程中各組腫瘤體積變化、體重變化及觀察末期瘤體重量。microPET檢測每組活體腫瘤的代謝情況。 結(jié)果： 1重組腺病毒的構(gòu)建 腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功后與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞,13天左右出毒,PCR檢測示Ad-EC擴增出revCasp3大小亞基879bp片段,Ad-GFP擴增出1482bp片段,示重組腺病毒Ad-EC及對照病毒Ad-GFP構(gòu)建成功。予擴增、純化后行滴度測定,Ad-EC滴度為6.3×109pfu/ml, Ad-GFP為3.89×101pfu/ml。重組腺病毒Ad-GFP感染72小時后,熒光顯微鏡下可見大量Hep-2細胞呈現(xiàn) 較強的綠色熒光信號,而NF細胞無明顯綠色熒光；流式細胞儀檢測見Hep-2細胞綠色熒光陽性率45%,NF細胞僅12%。Western blot結(jié)果顯示Ad-EC病毒作用72小時的Hep-2細胞EGFR蛋白表達減少,活化Caspase-3表達增多；而在NF細胞中無如上變化。表明SLPI啟動子能夠調(diào)控目的基因在Hep-2細胞中特異性表達。72小時為合適的感染時間。 2重組腺病毒對人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2的體外抑制作用 2.1細胞增殖抑制實驗 MTT結(jié)果顯示,重組腺病毒Ad-EC對Hep-2的增殖有較強的抑制作用且呈量效關(guān)系,MOI50感染72小時的抑制率為44.0%。DDP對Hep-2有較強的抑制作用,當其與Ad-EC合用時,效果明顯升高。Cetuximab和Ad-GFP對Hep-2的增殖抑制作用均較低。 2.2流式細胞儀定量分析細胞凋亡 Ad-EC MOI50感染Hep-272hr后能顯著誘導Hep-2凋亡(凋亡率36.1%),并且明顯高于其他單用組,P均0.001(DDP0.25μg/ml組凋亡率13.5%；Cetuximab500μg/ml組為3.5%；Ad-GFP MOI50組為6.5%)。而當與DDP合用時,凋亡率提高至61.2%,顯著高于Ad-EC和DDP單用組(P均0.001)。 2.3用iCELLigence實時無標記細胞功能分析(RTCA)技術(shù)實時檢測Hep-2細胞生長情況 Cell index(CI)值反映培養(yǎng)皿底部的電極因細胞貼壁形成的阻抗變化。Ad-ECMOI50組平臺期CI值為3.3-3.5,DDP0.25μg/ml組為2.8-3.0,均低于陰性對照組3.5-3.7,表現(xiàn)出一定的生長抑制作用；在Ad-EC+DDP合用組,CI值從用藥36hr后的最高值3.7持續(xù)滑落,一直到96hr結(jié)束檢測時的1.0,并仍保持下降趨勢,提示合用組具有更高效的細胞毒性作用。 2.4Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達 Ad-EC MOI50感染Hep-2細胞72hr后能使EGFR表達下調(diào),活化Caspase-3表達升高及PARP (poly ADP-ribose polymerase)剪切增多。在與DDP合用時上述變化更顯著。 3喉癌荷瘤模型的腫瘤生長抑制作用 Ad-EC以MOI50瘤內(nèi)注射,與PBS對照組相比,用藥30天后腫瘤體積和瘤重明顯降低(P0.05),葡萄糖攝取減少,而裸鼠體重、日常行為等與對照組相仿。DDP組腫瘤體積和瘤重較對照組顯著降低(P0.05),但裸鼠體重較對照組減輕(P0.05)。Ad-EC與DDP合用后加強了腫瘤抑制作用,然而對裸鼠體重增長的影響也較DDP組更加明顯(P0.05)。結(jié)論： 1.荷載有SLPI啟動子調(diào)控下的針對EGFR的人工microRNA和重組活化型Caspase-3的重組腺病毒Ad-EC構(gòu)建成功。 2.體外實驗顯示重組腺病毒Ad-EC能有效抑制喉癌細胞的生長和誘導細胞凋亡,且呈劑量相關(guān),與DDP合用可提高抑瘤作用； 3.應(yīng)用荷瘤裸鼠模型的體內(nèi)實驗顯示,重組腺病毒Ad-EC明顯抑制腫瘤生長,與DDP合用時抑瘤作用增強。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.65

【共引文獻】

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本文編號：1694057