本文選題：Metadherin　切入點：ERK1/2　出處：《山東大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景和目的乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率占到全身各種惡性腫瘤發(fā)病率的7%-10%,而且乳腺癌的全球發(fā)病率自20世紀(jì)末以來一直呈上升趨勢,每年約有140萬人被診斷為乳腺癌,約50萬人死于乳腺癌。我國雖然不是乳腺癌的高發(fā)病國家,但其發(fā)病率目前也已位居我國女性惡性腫瘤的首位,是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的疾病。雖然隨著人們健康意識的提高,健康查體的普遍認(rèn)可,乳腺癌的早期診斷率得到提高,早診斷早治療明顯改善了乳腺癌患者的預(yù)后。而且隨著乳腺癌治療理念的進(jìn)步,治療藥物的不斷改進(jìn),乳腺癌綜合治療、個體化治療的有效實施也明顯提高了乳腺癌患者的生存率,延長了生存時間。但是并不是所有乳腺癌患者都有明顯的獲益,像預(yù)后較差的三陰性乳腺癌患者以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者大都面臨著治療效果不理想,生存時間短的結(jié)局,這一部分患者的治療仍然是乳腺癌基礎(chǔ)和臨床研究面臨的挑戰(zhàn)。惡性腫瘤的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中都離不開腫瘤的血管生成。血管生成可以為腫瘤細(xì)胞的不斷增殖提供足夠的營養(yǎng),為腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供橋梁。臨床前期模型的研究證實,在乳腺增生惡性轉(zhuǎn)化,即出現(xiàn)形態(tài)變化之前,血管生成就已經(jīng)發(fā)生。經(jīng)刺激血管生成多肽轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞也表現(xiàn)出了更強(qiáng)的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。既然血管生成與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián),通過抗血管生成的靶向治療可能成為乳腺癌治療的又一種有效手段。對乳腺癌血管生成機(jī)制的深入研究,不僅有助于進(jìn)一步了解乳腺癌的發(fā)展機(jī)制,也能為乳腺癌抗血管生成靶向治療提供理論依據(jù)。研究證實,血管生成的過程需要多種分子通路的參與,亦受到多種基因及microRNA的調(diào)控。Metadherin (MTDH)基因作為一種多能癌基因,在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá),在惡性腫瘤中高表達(dá)。其在促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展,浸潤轉(zhuǎn)移及化療耐藥等多個方面都發(fā)揮重要作用。我們的研究團(tuán)隊在對MTDH與乳腺癌相關(guān)的研究中證實,MTDH高表達(dá)可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移,能夠通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體來抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡,還能通過下調(diào)PTEN來介導(dǎo)ER依賴的乳腺癌的生長和他莫昔芬耐藥。在研究中還發(fā)現(xiàn),MTDH在乳腺癌細(xì)胞中的高表達(dá)與一些腫瘤血管新生標(biāo)記物,如MMP-2、CD31等的表達(dá)上調(diào)有密切聯(lián)系,MTDH可能也具有調(diào)控乳腺癌的血管生成的作用,因此此研究的目的就是探討MTDH對乳腺癌的血管生成的調(diào)控并探索相關(guān)分子機(jī)制。MiRNA-21是最早發(fā)現(xiàn)的微小RNA之一,其功能類似于癌基因。研究證實在乳腺癌中miRNA-21高表達(dá),且與乳腺癌的TNM分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性,是乳腺癌高侵襲性的獨立的分子標(biāo)志。miRNA-21可以通過調(diào)節(jié)金屬原肌球蛋白(TPM1),程序性死亡蛋白4(PDCD4)和乳腺絲抑蛋白促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。干擾miRNA-21的表達(dá)則可以負(fù)反饋于PTEN來逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的EMT。我們通過微陣列基因芯片技術(shù)對干擾MTDH表達(dá)后的MAD-MB-231細(xì)胞系進(jìn)行miRNA差異表達(dá)譜分析以及實時定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)有91種miRNA表達(dá)水平降低,miR-21是其中下降明顯的miRNA之一。有研究報道了miRNA-21可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的血管生成,本研究中我們也探究在MTDH調(diào)控乳腺癌細(xì)胞血管生成的機(jī)制中,miRNA-21是否也發(fā)揮了作用。研究方法為了研究MTDH對乳腺癌血管生成的調(diào)控,我們選擇具有三陰性乳腺癌特性的MDA-MB-231細(xì)胞系進(jìn)行研究。前期研究已經(jīng)正實,MDA-MB-231細(xì)胞系是高表達(dá)MTDH的。首先設(shè)計針對MTDH的干擾序列,構(gòu)建shRNA,然后插入pSUPER.retro、pure載體,經(jīng)過測序驗證后用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞系。然后篩選并建立穩(wěn)定低表達(dá)MTDH的細(xì)胞系及空載體的對照細(xì)胞系。通過實時定量PCR和western blot驗證干擾效果。然后收集制備腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM)：消化計數(shù)等量實驗組和對照組的細(xì)胞,置于相同大小培養(yǎng)瓶,用含10%胎牛血清的全培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時。然后棄去培養(yǎng)基,PBS沖洗3遍后加入無血清培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)箱培育24小時候后收集上清液,先后離心去除細(xì)胞及細(xì)胞碎屑,儲存于-80℃冰箱備用。通過血管生成相關(guān)的體外實驗：小管形成實驗、小鼠主動脈環(huán)實驗和雞胚絨毛尿囊膜實驗,來檢測干擾MDA-MB-231細(xì)胞的MTDH后對其血管生成能力的影響,從而揭示MTDH對乳腺癌血管生成的調(diào)控作用。小管形成實驗：將96孔板用50μl基質(zhì)膠覆蓋,37℃放置30分鐘使基質(zhì)膠凝固。取對數(shù)生長期的HUVECs消化計數(shù),用制備好的條件培養(yǎng)基(TCM)重懸HUVECs,然后分別取100gL約含1×105的細(xì)胞加入96孔板的每一孔中。在細(xì)胞培養(yǎng)箱培育6小時后,顯微鏡下觀察管腔結(jié)構(gòu)的形成情況。隨機(jī)選取10個視野,計數(shù)形成的管腔結(jié)構(gòu)并統(tǒng)計分析。小鼠主動脈環(huán)實驗：將48孔板用100μL基質(zhì)膠覆蓋,37℃放置30分鐘使基質(zhì)膠凝固。在麻醉狀態(tài)下,將4周齡大小的BALB/c小白鼠的胸主動脈進(jìn)行分離并切下,然后將其切斷,分成長度約2mm的動脈環(huán)。將動脈環(huán)放入48孔板中后,再覆蓋100μL的基質(zhì)膠。待基質(zhì)膠凝固后,每個孔中加入200μL制備的TCM。將48孔板放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并每天顯微鏡下觀察主動脈環(huán)的新生血管的情況,第5天記數(shù)每個孔的新生血管數(shù)量。雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗：取20枚種雞卵隨機(jī)分為2組,置于37℃相對濕度80%的恒溫恒濕環(huán)境中培養(yǎng)3天。于之前標(biāo)記好的蛋殼位置開一約1cm2的小窗,小心分離卵殼膜,避免損傷尿囊膜,使卵殼膜與尿囊膜分離形成人工氣室。第二天,在無菌條件下分別將100μL不同的TCM加入尿囊膜表面,然后封閉小窗。繼續(xù)孵育5-7天,收取尿囊膜,顯微鏡下觀察血管生成情況并計數(shù)統(tǒng)計。除了進(jìn)行細(xì)胞學(xué)的實驗,我們還收集了84例人乳腺癌的組織標(biāo)本,通過免疫組化技術(shù),檢測乳腺癌組織中MTDH的表達(dá)與微血管密度(MVD)之間的關(guān)系,并統(tǒng)計分析與乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性,來進(jìn)一步驗證乳腺癌組織中MTDH與血管生成的關(guān)系及其臨床意義。為了闡明MTDH調(diào)控乳腺癌血管生成的分子機(jī)制,我們通過實時定量PCR和western blot來檢測與血管生成相關(guān)的AKT通路和ERK1/2通路的表達(dá)情況,篩選可能的信號通路。我們還檢測通路下游與血管生成的分子標(biāo)記物VEGF、MMP2,了解它們表達(dá)水平的變化。為了探究是否有microRNA (miRNA)在MTDH調(diào)控血管生成的機(jī)制中發(fā)揮作用,我們通過微陣列基因芯片技術(shù)對干擾了MTDH的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行miRNA的差異表達(dá)譜分析及實時定量PCR的驗證,發(fā)現(xiàn)miRNA-21是差異表達(dá)明顯的miRNA之一,于是我們用脂質(zhì)體2000向干擾了MTDH的MDA-MB-231細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染了miRNA-21 mimics。收集制備條件培養(yǎng)基,然后通過小管形成實驗,小鼠動脈環(huán)實驗來驗證轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后對MDA-MB-231-prpM細(xì)胞的血管生成能力的影響。因為PTEN是miRNA-21的下游靶基因之一,且參與調(diào)控ERK1/2通路,因此我們檢測了轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后,MDA-MB-231-prpM細(xì)胞的PTEN表達(dá)情況,并檢測轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后VEGF、MMP2的表達(dá)水平變化。結(jié)果構(gòu)建的干擾載體并經(jīng)測序檢測后,轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞系。通過嘌呤霉素篩選建立穩(wěn)定的低表達(dá)MTDH的MDA-MB-231-prpM細(xì)胞系,以及空載體的對照MDA-MB-231-prpn細(xì)胞系。通過實時定量PCR、western blot檢測干擾效率,可見MTDH在mRNA水平和蛋白水平均明顯降低(P0.01)。為了解干擾MTDH基因表達(dá)對乳腺癌血管生成的影響,我們首先通過小管形成實驗,將TCM作用于HUVECs,觀察MTDH對小管形成能力的影響,結(jié)果顯示干擾MTDH的MDA-MB-231-prpM細(xì)胞能明顯抑制其小管形成能力(P0.01)。將TCM作用于小鼠主動脈環(huán),觀察動脈環(huán)周圍新生血管的形成,我們發(fā)現(xiàn)干擾MTDH的MDA-MB-231-prpM細(xì)胞的新生血管形成能力明顯降低(P0.05)。通過雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗,我們發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231-prpM細(xì)胞的TCM明顯抑制絨毛尿囊膜的血管生成(P0.05)。通過對人三陰性乳腺癌組織標(biāo)本的免疫組化染色,檢測MTDH和微血管密度標(biāo)記物CD31的關(guān)系：84例組織標(biāo)本中,MTDH高表達(dá)48例,其中CD31高表達(dá)33例；MTDH低表達(dá)36例,其中CD31高表達(dá)14例,差異具有統(tǒng)計意義(P=0.017),相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)MTDH表達(dá)與微血管密度相關(guān)(r=0.698 P=0.006),而且MTDH高表達(dá)還與乳腺癌的腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期,脈管浸潤具有相關(guān)性。通過對血管生成相關(guān)分子通路的篩選,發(fā)現(xiàn)干擾MTDH表達(dá)后,p-AKT表達(dá)升高,p-ERK1/2表達(dá)降低,血管生成相關(guān)的分子標(biāo)記物VEGF、MMP2均明顯降低。故認(rèn)為MTDH調(diào)控血管生成的通路為ERKl/2通路,而不是AKT通路。我們在MDA-MB-231-prpM細(xì)胞系內(nèi)瞬時轉(zhuǎn)染了miRNA-21 mimics后,通過實時定量PCR來檢測證實miRNA-21表達(dá)水平明顯上調(diào)(p0.01),然后通過小管形成實驗和小鼠動脈環(huán)實驗來驗證miRNA-21上調(diào)對MDA-MB-231-prpM細(xì)胞血管生成能力的影響,發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231-prpM細(xì)胞的小管形成能力明顯提高(p0.01)。通過小鼠主動脈環(huán)實驗將TCM作用于小鼠主動脈環(huán),觀察新生血管分支情況,發(fā)現(xiàn)上調(diào)了miRNA-21的MDA-MB-231-prpM細(xì)胞形成新生血管分支的能力也較前提高(P0.05)。但與MDA-MB-231-prpn比較仍有差異(P0.05),這一結(jié)果證實了上調(diào)miRNA-21水平后可以部分逆轉(zhuǎn)干擾MTDH對MDA-MB-231細(xì)胞血管生成的抑制作用。通過western blot實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miRNA-21下游的PTEN表達(dá)下降,p-ERK1/2上升,VEGF和MMP2的表達(dá)水平升高。結(jié)論1.干擾MTDH可以抑制乳腺癌的血管生成2. MTDH通過MTDH/miRNA-21/PTEN/ERK1/2通路來調(diào)控乳腺癌的血管生成意義1.證實了MTDH調(diào)控乳腺癌的血管生成的功能。2.初步闡述了MTDH調(diào)控乳腺癌血管生成的分子機(jī)制。3.為MTDH成為乳腺癌分子靶向治療的新靶點提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:The study of angiogenesis in breast cancer has been shown to be an effective method for breast cancer . In order to study the effect of MTDH on angiogenesis of breast cancer cells , we also studied the effect of MTDH on the angiogenesis of breast cancer cells . In order to clarify the effect of MTDH on the angiogenesis of breast cancer , we detected the relationship between MTDH expression and microvessel density ( MVD ) in breast cancer tissues by means of real - time quantitative PCR and western blot .
The expression level of MDA - MB - 231 - prpM was significantly higher than that of MDA - MB - 231 - prpn ( P < 0.01 ) . MTDH regulates angiogenesis in breast cancer by MTDH / miRNA - 21 / PTEN / ERK 1 / 2 pathway . MTDH regulates angiogenesis in breast cancer .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【共引文獻(xiàn)】

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1 張寧;Metadherin調(diào)控乳腺癌進(jìn)展轉(zhuǎn)移和TRAIL敏感性的分子機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2014年

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本文編號：1683191