發(fā)布時間：2018-03-29 06:29

  本文選題：肝細(xì)胞癌　切入點(diǎn)：glypican-3　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：目的:基于glypican-3在人肝癌組織中的特異表達(dá),構(gòu)建靶向glypican-3熒光探針,在細(xì)胞、動物及人體水平探索其在肝細(xì)胞癌診斷中的應(yīng)用。方法:(1)構(gòu)建靶向glypican-3熒光探針并進(jìn)行探針表征、安全性及穩(wěn)定性驗(yàn)證;(2)利用Western blot及RT-PCR驗(yàn)證glypican-3在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平;(3)利用流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)glypican-3在HepG2細(xì)胞膜表面表達(dá);(4)設(shè)置不同時間梯度,利用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HepG2細(xì)胞及永生化正常肝細(xì)胞系L02對靶向glypican-3熒光探針的攝取水平;(5)建立裸鼠HepG2皮下瘤模型及U87皮下瘤模型,尾靜脈注射靶向glypican-3熒光探針并利用小動物活體成像設(shè)備觀察其在體分布及代謝,設(shè)置抗體提前封閉組及作為對照;(6)利用體式熒光顯微鏡驗(yàn)證該探針在近紅外光下手術(shù)導(dǎo)航切除肝癌的應(yīng)用;(7)對肝臟惡性腫瘤患者超聲引導(dǎo)下組織活檢,活檢組織取出后即刻噴灑靶向glypican-3熒光探針,利用近紅外顯像系統(tǒng)觀察腫瘤組織及周圍正常組織的探針熒光蓄積情況。與患者術(shù)后病理活檢診斷進(jìn)行對比,探索肝細(xì)胞癌組織近紅外熒光顯像與病理診斷及glypican-3表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建靶向glypican-3熒光探針且該探針在血清中穩(wěn)定性較高,體外及在體實(shí)驗(yàn)均證實(shí)該探針安全無毒;(2) Western blot 及 RT-PCR 證實(shí) glypican-3 蛋白在 HepG2 細(xì)胞蛋白及 mRNA水平特異性高表達(dá);(3)流式細(xì)胞術(shù)及激光共聚焦實(shí)驗(yàn)證實(shí)glypican-3在HepG2細(xì)胞膜表面高表達(dá);(4)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)與L02細(xì)胞系相比,HepG2細(xì)胞系與探針共孵育30分鐘后即可特異攝取靶向glypican-3熒光探針,glypican-3抗體提前封閉HepG2細(xì)胞后可顯著降低HepG2細(xì)胞對的特異探針攝取。HepG2細(xì)胞對靶探針的攝取能力隨著孵育時間的延長而增加;(5)尾靜脈注射靶向glypican-3熒光探針后,探針可在裸鼠HepG2腫瘤內(nèi)特異性蓄積,尾靜脈注射探針6小時后腫瘤與周邊組織熒光對比度最強(qiáng);(6)裸鼠模型證實(shí)該探針可應(yīng)用于近紅外光下手術(shù)導(dǎo)航切除肝癌;(7)對人肝臟惡性腫瘤組織的近紅外成像顯示,肝細(xì)胞癌噴灑熒光探針后熒光強(qiáng)度較肝轉(zhuǎn)移癌及周邊正常肝臟顯著升高(P0.01)。當(dāng)腫瘤組織與周邊肝組織近紅外熒光強(qiáng)度比值2.32時對HCC診斷效能最高,敏感度為83.3%、特異度為100%。腫瘤組織應(yīng)用探針后熒光強(qiáng)度與組織glypican-3表達(dá)水平密切相關(guān),且有無肝硬化對于腫瘤組織熒光強(qiáng)度無顯著影響。結(jié)論:本研究中構(gòu)建的靶向glypican-3近紅外熒光探針可應(yīng)用于用于肝細(xì)胞癌的臨床診斷。
[Abstract]:Objective: the specific expression of Glypican-3 in human hepatocellular carcinoma based on the construction of the probe target, to explore the Glypican-3 fluorescence in the cell, animal and human level and its application in diagnosis of hepatocellular carcinoma. Methods: (1) construction of targeted Glypican-3 fluorescent probe and probe characterization, verification of safety and stability; (2) the expression level of blot using Western and RT-PCR verification of Glypican-3 in HCC cell lines; (3) using flow cytometry and immunofluorescence experiments confirmed that the expression of Glypican-3 on HepG2 cell membrane; (4) setting different time gradient of targeted Glypican-3 fluorescent probe uptake levels by immunofluorescence experiments and HepG2 cells immortalization of normal liver cell line L02; (5) establish HepG2 nude mice subcutaneous tumor model and U87 subcutaneous tumor model, intravenous injection of Glypican-3 targeted fluorescent probes and with small animal imaging equipment to observe the in vivo Distribution and metabolism, set in advance as control group and antibody closed; (6) to verify the application of navigation resection to the probe surgery in the near-infrared light with stereo fluorescence microscope; (7) guided biopsy of liver biopsy in patients with malignant tumor ultrasound, removed immediately after spraying the probe target to Glypican-3 fluorescence probe, fluorescence observation tumor tissue and surrounding normal tissue using near infrared imaging system. The accumulation were compared with the pathological diagnosis of biopsy patients, to investigate the relationship between hepatocellular carcinoma and the expression of near infrared fluorescence imaging and pathological diagnosis of Glypican-3. Results: (1) targeting Glypican-3 is successfully constructed and the fluorescence probe probe in the serum stability higher. In vitro and in vivo experiments have confirmed that the probe is safe and non-toxic; (2) Western blot and RT-PCR confirmed that Glypican-3 protein in HepG2 cells and mRNA protein level of specificity High expression; (3) flow cytometry and confocal laser experiments confirmed that the high expression of Glypican-3 in HepG2 cell membrane; (4) immunofluorescence experiments confirmed that compared with L02 cells, HepG2 cells and probe were incubated for 30 minutes specific uptake targeting Glypican-3 fluorescence probe, Glypican-3 antibody HepG2 closed in advance cells can significantly reduce the uptake ability of HepG2 cells to the specific probes of the probe target uptake in.HepG2 cells increased with prolonged incubation incubation time; (5) intravenous injection of Glypican-3 targeted fluorescent probe, the probe can accumulate in mice HepG2 tumor specific probe, intravenous injection 6 hours after the tumor and surrounding tissue fluorescence the strongest contrast; (6) nude mice confirmed that the probe can be applied to near infrared surgical navigation under the resection of hepatocellular carcinoma; (7) the near infrared imaging of tissues of liver malignant tumors showed hepatocellular carcinoma spray. The optical probe fluorescence intensity than liver metastatic carcinoma and surrounding normal liver was significantly increased (P0.01). When the tissue and surrounding liver tissues near infrared fluorescence intensity ratio of 2.32 HCC to the highest diagnostic efficiency, the sensitivity was 83.3%, specificity of 100%. in tumor tissue after application of probe fluorescence intensity and Glypican-3 levels are closely related, and there is no cirrhosis for tumor tissue fluorescence intensity had no significant effect. Conclusion: the constructed targeting Glypican-3 near infrared fluorescent probe can be applied for clinical diagnosis of hepatocellular carcinoma.

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1679947