本文選題：miR-664　切入點：骨肉瘤細胞　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是主要發(fā)病于兒童和青少年且發(fā)病率最高的原發(fā)性惡性骨腫瘤。目前應(yīng)用手術(shù)、化療以及放療等傳統(tǒng)治療仍有很多病例會出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移,以肺轉(zhuǎn)移最常見,轉(zhuǎn)移患者存活率仍然較低,骨肉瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)是影響患者存活率的主要影響因素。因此有必要深入探究骨肉瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的機制,通過發(fā)現(xiàn)新的治療手段抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移以提高骨肉瘤患者的存活率。但骨肉瘤轉(zhuǎn)移是涉及腫瘤細胞遷移和侵襲為主的多因素、多階段的復(fù)雜環(huán)節(jié),受到多個促腫瘤轉(zhuǎn)移癌基因的調(diào)控,目前其轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機制仍未闡明。miRNA是一類主要存在真核生物中長約18-25個堿基的的非編碼的RNA分子,通過與靶基因的3'UTR堿基互補配對直接抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)翻譯,在基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),通過調(diào)控不同的靶基因促進或抑制腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、分化、凋亡以及血管生成的過程。越來越多的研究表明,一些miRNA在骨肉瘤患者中表達異常,調(diào)控著骨肉瘤細胞的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)行為�；蛐酒Y查發(fā)現(xiàn)miR-664在骨肉瘤中過表達并與骨肉瘤患者的存活率相關(guān),但在骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲中miR-664是否發(fā)揮著某種作用以及相應(yīng)的靶基目前尚不清楚。研究目的：一、選取不同株的人骨肉瘤細胞株以及骨肉瘤組織標本,探究：1、骨肉瘤細胞株相對于正常人成骨細胞株miR-664的表達水平；2、骨肉瘤組織相對于癌旁組織miR-664的表達水平。二、構(gòu)建miR-664 mimic、miR-664 inhibitor、miR-664 negative control質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染進入MG-63骨肉瘤細胞株,建立穩(wěn)定過表達或低表達miR-664的細胞株,利用Transwell趨化、侵襲實驗和細胞劃痕實驗探究：1、轉(zhuǎn)染miR-664 mimic質(zhì)粒相對于miR-664 negative control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MG-63骨肉瘤細胞株中骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力；2、轉(zhuǎn)染miR-664 inhibitor質(zhì)粒相對于miR-664 negative control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MG-63骨肉瘤細胞株中骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力。三、利用生物信息學(xué)方法預(yù)測：1、miR-664作用的靶基因；2、檢測所篩選的miR-664靶基因的生物學(xué)功能及可能的作用信號通道。研究方法：1、骨肉瘤細胞培養(yǎng)人骨肉瘤細胞株SOSP-9607、U2-OS、SAOS-2、HOS、MG-63采用含100U/ml青霉素和1 00U/ml鏈霉素的10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),人成骨細胞株hFOB1.19采用DMEM/F12培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng),細胞生長狀態(tài)良好時用于實驗,2-3天換液一次,根據(jù)細胞的密度傳代。2、骨肉瘤組織標本收集8例骨肉瘤癌組織和對應(yīng)癌旁組織(adjacent noncancerous tissues, TAT)均來源于湖南省郴州市第一人民醫(yī)院及廣東省韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院標本庫,所有標本均為活體組織取下后即放于液氮中保存直至使用。所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為骨肉瘤,尚未接受放化療治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。3、RNA抽提與熒光定量PCR分別利用mirVana miRNA抽提試劑盒從培養(yǎng)的細胞和新鮮切除的骨肉瘤組織中抽提RNA,利用Taqman miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA, miR-664的表達水平通過miRNA特異性的TaqMan MicroRNA試劑盒,使用ABI公司的7500 Real-time PCR儀進行熒光定量PCR反應(yīng),檢測各模板的Ct值(C為cycle,T為threshold),每個樣品重復(fù)3次,陰性對照采用DNase/RNase-free water為模板,通過相對定量以Folds=2-ΔΔCt值代表基因的相對表達強度,公式如下：-ΔΔCt=2-lCt(miR-664)-Ct(U6)]4、Western blot提取細胞內(nèi)總蛋白,采用考馬斯亮藍法對蛋白進行濃度測定。采用SDS-PAGE對蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜后,用5%脫脂牛奶封閉,加入SOX7一抗、相應(yīng)的二抗,顯影和定影。使用a-tubulin作為內(nèi)參。5、細胞的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24h,將MG-63細胞用0.25%胰酶消化離心計數(shù)后,將細胞密度調(diào)整至5×105/ml,將各組(miR-664 mimic、miR-664 inhibitor、miR-664 negative control)5μg重組質(zhì)粒與lipofectamine 2000混合,輕輕混勻后室溫孵育20min,加入到已經(jīng)接種細胞的6孔板內(nèi),37℃、5%CO2飽和濕度下的培養(yǎng)箱中孵育6h,將培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后抽提細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,熒光定量PCR檢測瞬時轉(zhuǎn)染后各組miR-664的表達,6、細胞劃痕實驗劃痕實驗前48h,將細胞密度調(diào)整至5×105/ml,接種單細胞懸液于六孔板中培養(yǎng)24h,使細胞的密度達到約90-95%后將細胞培養(yǎng)上清吸出,再更換無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞24h,使用20μl無菌的加樣槍頭在每孔中長滿細胞的單細胞層中輕輕并迅速地劃1-2道痕,用新鮮的無菌PBS沖洗板1次除去上清中漂浮的細胞并更換新鮮的完全培養(yǎng)基。分別在0h與24h時間點在顯微鏡下拍照。測量劃痕兩側(cè)細胞之間的距離,每組設(shè)平行3個孔,計算0h的最大劃痕與24h測劃痕距離,計算不同組細胞劃痕修復(fù)的速度,計算三個孔的平均值。7、ELISA試劑盒說明書的說明,將標準品用蒸餾水稀釋到指定的濃度,將待檢測的上清樣品用sample diluent稀釋。計算好總的樣本數(shù)(包括標準品孔、空白孔、以及樣品孔,其中樣品孔每個樣品做相應(yīng)的復(fù)孔),取出已經(jīng)包被好MMP9的96孔板,分別每孔加入100μl標準品或樣品,空白孔加入相應(yīng)量的樣品稀釋液,而后加入50μl稀釋好的一抗,37℃孵育2h,用washing buffer洗5次,每次1-2min；分別每孔加入100μl稀釋好的二抗,室溫孵育30min后用washing buffer洗三次,每次3min。加入底物TMB,每孔100μl,顯色15min后,每孔加入100μl終止液；450nm吸收波長測吸光值,計算細胞因子的相對濃度。8、骨肉瘤3D培養(yǎng)模型將細胞濃度調(diào)整至2×105/ml。將Matrigel膠完全覆蓋24孔板底時,將24孔培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中約1h,待Matrigel膠重新凝固；將細胞懸液加入其中,置于37℃,5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天,10天內(nèi)每隔2天在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài),并拍攝相應(yīng)的照片。9、Transwell小室趨化和侵襲實驗接種1.0×104個細胞于Transwell小室中,將50μl稀釋好的Matrigel基質(zhì)膠均勻鋪于Transwell小室底部,37℃培養(yǎng)箱中放置3h。將各組MG-63骨肉瘤細胞接種前12h用無血清DMEM培養(yǎng)以去除血清對實驗結(jié)果的影響。小室內(nèi)加入200μl的無血清的DMEM培養(yǎng)基,于transwell小室下腔加入500gl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后從24孔板中取出Transwell、室,1×PBS輕輕沖洗3次,用棉簽擦盡小室內(nèi)的細胞,然后將小室置于1%多聚甲醛中固定10min,取出小室放入蘇木精中浸泡,染色5min。沿小室底部邊緣剪下濾膜,顯微鏡下觀察穿透濾膜或Matrigel膠的細胞,于200倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)5個視野的細胞,取平均值,重復(fù)計數(shù)3次。10、生物信息學(xué)預(yù)測利用TargetScan (http://www.targetscan.org) miRNA靶基因預(yù)測的生物信息學(xué)網(wǎng)站中對miR-664的靶基因進行分析預(yù)測,分析顯示SOX7可能是miR-664潛在作用的靶基因。11、熒光素報告酶系統(tǒng)檢測由廣州復(fù)能基因有限公司合成重組質(zhì)粒pGL3-SOX73'UTR,將miR-664mimic、inhibitor、negative control、mut與pGL3-SOX73'UTR共同轉(zhuǎn)染進入MG-63骨肉瘤細胞。轉(zhuǎn)染48h后吸去上清中的培養(yǎng)基,用PBS清洗2次,每孔加入100μl Passive Lysis Buffer,室溫輕輕振蕩,裂解15min,先用GloMax生物發(fā)光檢測儀讀取細胞裂解后的背景值,每孔加入100μl luciferase底物,渦旋振蕩混勻,讀取相應(yīng)的值,每孔加入100μlStop Reagent,振蕩混勻后,測定各組熒光值。12、siNRA轉(zhuǎn)染為進一步明確miR-664是否通過SOX7進行調(diào)控骨肉瘤MG-63細胞侵襲遷移能力,我們利用SOX7 siRNA干擾SOX7的表達并進一步利用Transwell趨化、侵襲實驗觀察低表達SOX7對MG-63骨肉瘤侵襲遷移能力的影響。SOX7siRNA#1及SOX7 siRNA#2由廣州銳博生物科技有限公司合成并純化,序列如下：SOX7 siRNA#1:TCTTGCTACAAAGCCTAAGTG SOX7 siRNA#2:TTGTCCATCCGACAGCTCGGC選MG-63 inhibitor組進行轉(zhuǎn)染,方法如步驟5所述,分為MG-63 miR-664 inhibitor+NC、MG-63-miR-664 inhibitor+SOX7 siRNA#1、MG-63-miR-664 inhibitor+SOX7 siRNA#2三組。13、Western blot檢測SOX7 siRNA干擾后SOX7表達轉(zhuǎn)染48小時后收集各組細胞并應(yīng)用Western blot檢測SOX7蛋白水平,方法如步驟4所述。14、siRNA干擾后transwell趨化、侵襲實驗取NC組、SOX7 siRNA#1組及SOX7 siRNA#2組MG-63骨肉瘤細胞進行Transwell趨化、侵襲實驗,方法如步驟9所述。15、統(tǒng)計學(xué)方法各骨肉瘤細胞株與人成骨細胞株hFOB1.19 miR-664的表達,mimic組與NC組、inhibitor組與NC組SOX7、β-catenin及MMP7蛋白的表達,NC組與mimic組、NC組與inhibitor組,NC組與mut組熒光酶活性涉及的兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用兩獨立樣本的t檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；mimic組與NC組、inhibitor組與NC組、mut組與NC組的MMP9表達涉及的兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用兩獨立樣本的t檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；siRNA#1組與NC組、siRNA#2組與NC組的SOX7蛋白表達、Transwell趨化實驗、Transwell侵襲實驗中涉及的兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用兩獨立樣本的t檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。利用雙變量分析組織中miR-664與SOX7表達的相關(guān)性。研究結(jié)果：1、miR-664在骨肉瘤細胞株和骨肉瘤組織中的表達水平顯著上調(diào)相較于對照組人成骨細胞株hFOB1.19細胞株,miR-664在5種骨肉瘤細胞株中(HOS、SAOS-2、SOSP-9607、MG-63和U2-OS)均顯著表達上調(diào)(P0.05),8例骨肉瘤組織標本中的miR-664表達顯著高于對應(yīng)的癌旁組織(P0.05)。2、miR-664過表達可提高MG-63骨肉瘤細胞在體外的遷移和侵襲能力轉(zhuǎn)染miR-664 mimic后MG-63骨肉瘤細胞miR-664的表達增高了17.998倍(P0.05)。Transwell小室遷移和侵襲實驗顯示無論上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜或Matrigel膠相隔,mimic組穿透濾膜或Matrigel膠的染色細胞均較NC組顯著增加(P0.05)。利用Matrigel膠建立骨肉瘤細胞3D培養(yǎng)的結(jié)果顯示mimic組MG-63骨肉瘤細胞在10天的培養(yǎng)過程中逐漸生成無極性球狀細胞克隆,隨著培養(yǎng)時間的延長細胞克隆表面開始伸出絲狀偽足,而NC組的細胞3D培養(yǎng)下的形態(tài)生成較小的球狀克隆及形成較少的絲狀偽足。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示mimic組的MG-63骨肉瘤細胞劃痕修復(fù)速度顯著快于NC組(P0.05)。3、下調(diào)miR-664可以降低MG-63骨肉瘤細胞在體外的遷移和侵襲能力轉(zhuǎn)染miR-664 inhibitor后MG-63骨肉瘤細胞miR-664的表達降低了78.7%(P0.05)。Transwell小室遷移和侵襲的實驗顯示無論上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜或Matrigel膠相隔,inhibitor組穿透濾膜或Matrigel膠的染色細胞較NC組顯著減少(P0.05)。利用Matrigel膠建立骨肉瘤細胞3D培養(yǎng)的結(jié)果顯示inhibitor組MG-63骨肉瘤細胞在10天的培養(yǎng)過程中生成無極性球狀細胞克隆較NC組小且無明顯絲狀偽足。細胞劃痕的實驗結(jié)果顯示inhibitor組MG-63骨肉瘤細胞劃痕修復(fù)速度顯著慢于NC組(P0.05)。4、SOX7基因是miR-664直接作用的靶基因我們利用TargetScan (http://www.targetscan.org) miRNA靶基因預(yù)測的生物信息學(xué)網(wǎng)站對miR-664的靶基因進行分析預(yù)測,根據(jù)miRNA與靶基因3’UTR不完全配對的原則分析顯示SOX7可能是miR-664潛在作用的靶基因。分別檢測mimic組、inhibitor組及NC組MG-63骨肉瘤細胞中SOX7、β-catenin及MMP7蛋白的表達水平。Western blot結(jié)果顯示,與NC組相比mimic組中的SOX7蛋白表達顯著下降(P0.05),而β-catenin、MMP7蛋白表達顯著上升(P0.05)；inhibitor組SOX7蛋白表達量顯著上升(P0.05),而β-catenin、MMP7蛋白表達顯著下降(P0.05)。為進一步驗證SOX7的3'UTR是否具有miR-664結(jié)合的位點,構(gòu)建SOX7蛋白的3’UTR部分序列表達載體pGL3-SOX73'UTR,將其分別與miR-664 mimic、inhibitor negative control及mut共同轉(zhuǎn)染到MG-63骨肉瘤細胞中,利用pGL3熒光素酶報告系統(tǒng)監(jiān)測miR-664是否與SOX7蛋白相結(jié)合。與NC組相比,將pGL3-SOX73'UTR與miR-664 mimic共轉(zhuǎn)染可顯著降低熒光素酶的活性(P0.05),將pGL3-SOX73'UTR與miR-664 inhibitor共轉(zhuǎn)染可顯著增強熒光素酶的活性(P0.05),而將pGL3-SOX73'UTR與miR-664 mut或miR-664 negative control共轉(zhuǎn)染均不能改變熒光素酶的活性(P0.05),提示miR-664與SOX7'3UTR可特異性結(jié)合,即SOX7是miR-664的靶基因。ELISA結(jié)果顯示與NC組相比mimic組中的MMP9表達顯著上升(P0.05),而inhibitor組MMP9表達顯著下降(P0.05)。5、抑制SOX7表達促進MG-63骨肉瘤細胞在體外的遷移和侵襲為了進一步驗證SOX7在骨肉瘤體外的遷移和侵襲中的功能,我們在inhibitor組MG-63骨肉瘤細胞株中利用siRNA干擾SOX7的表達,Transwell小室趨化、侵襲實驗結(jié)果顯示,相對于NC組,siRNA干擾后骨肉瘤細胞MG-63的遷移和侵襲能力顯著增強(P0.05),兩種siRNA均對骨肉瘤細胞的遷移和侵襲具有顯著的促進作用。6、miR-664與SOX7基因表達在骨肉瘤病人組織中的相關(guān)性分析熒光定量PCR的結(jié)果顯示,6例骨肉瘤病人組織中miR-664相對于癌旁組織的表達顯著上調(diào)。相對于癌旁組織中,SOX7在骨肉瘤病人組織中的含量顯著下調(diào)。接下來我們對6例骨肉瘤組織和2例癌旁組織中miR-664表達水平與SOX7作相關(guān)性分析,統(tǒng)計學(xué)的結(jié)果顯示miR-664的表達水平與SOX7呈負相關(guān)的線性關(guān)系(r=-0.91,P0.05)。結(jié)論：1、miR-664在骨肉瘤細胞株和組織中表達水平顯著上調(diào)；2、過表達miR-664顯著促進骨肉瘤細胞株的遷移和侵襲；3、SOX7是miR-664作用的一個靶基因,抑制SOX7可顯著促進骨肉瘤細胞在體外的遷移和侵襲；4、miR-664和SOX7在骨肉瘤病人組織中的表達水平呈負相關(guān)性；5、SOX7可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響骨肉瘤細胞在體外的遷移和侵襲能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1

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5 閆紅衛(wèi);骨肉瘤臨床診治的影像學(xué)檢查優(yōu)化探討[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2016年

6 劉京偉;小兒長管骨骨毮炎與骨肉瘤影像學(xué)對比研究[D];山東大學(xué);2016年

7 王坤;GRM4基因多態(tài)性與骨肉瘤的遺傳易感性及臨床病理特征的相關(guān)性研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2016年

8 王汀;骨肉瘤治療研究進展[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

9 杜飛舟;骨肉瘤~（31）P磁共振波譜研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

10 張波;43例骨肉瘤患者預(yù)后的多因素分析[D];浙江大學(xué);2010年

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本文編號：1677613