本文選題：AM　切入點：siRNA　出處：《江蘇大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:腎上腺髓質素(adrenomedullin,AM)是日本學者首先在人手術切除的嗜鉻細胞瘤組織中分離出的一種多肽,其在正常人的血漿中以一定濃度存在,廣泛參與了血管的擴張和肺的擴張,對于血壓的調(diào)控、多種激素的調(diào)節(jié)有作用。近年越來越多的文獻報道AM在多種腫瘤組織中高表達,對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有調(diào)控作用。本研究驗證AM及其受體在胃癌組織中的表達情況,分析AM表達量與臨床病理之間的關系;進行系列體外實驗探索AM對胃癌細胞功能學方面的影響,試圖找出AM調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展的作用機制。希望該研究為臨床分子診斷胃癌及胃癌的靶向治療提供新的依據(jù)和思路。方法:利用免疫組方法檢測臨床胃癌標本中的差異表達,并分析AM差異表達與臨床病理之間的關系;運用IHC檢測AM及其受體CRLR、RAMP1、RAMP2、RAMP3的表達情況;運用RNAi穩(wěn)定的敲低BGC細胞AM的表達量,并觀察其對胃癌細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響,并試圖找出AM作用的信號通路;運用分子生物學技術構建穩(wěn)定的敲低和過表達AM的載體,觀察對胃癌細胞BGC-823自噬的影響。具體操作方法如下:1收集胃癌組織及其配對的癌旁組織,q RT-PCR分析AM基因的表達水平,IHC檢測AM的表達量,分析表達量與臨床病理之間的關系。分析AM在胃癌組織及癌旁組織的表達差異。運用IHC檢測臨床胃癌標本中AM的受體CRLR、RAMP1、RAMP2、RAMP3的表達情況。2選取分化程度不同的胃癌細胞株:BGC-823,MGC,SGC-790,HGC和MKN-45檢測AM表達水平。構建絕對定量載體檢測AM-m RNA水平表達情況。篩選出AM表達量最高的一株細胞。3設計并篩選針對AM的小干擾RNA,通過脂質體轉染到胃癌BGC-823細胞中,Westerning Blot驗證AM蛋白被成功的敲低后,進行平板克隆形成實驗,以驗證對胃癌細胞增殖的影響;進行細胞劃痕實驗,以驗證對胃癌細胞遷移的影響;進行Transwell小室實驗,以驗證對胃癌細胞侵襲的影響;進行Annexin V-FITC\PI細胞凋亡檢測實驗,以驗證對胃癌細胞凋亡的影響。4驗證JNK、P-JNK、AKT、P-AKT、PKA、P-PKA等相關的通路蛋白,驗證BCL2、BAX、caspase3、cleaved-caspase3凋亡相關的通路蛋白,試圖找出AM發(fā)揮作用的信號通路。5構建GFP-LC3A/B載體,Lipofectamine2000轉染細胞,同時分別轉染特異性針對AM的小干擾RNA序列和pc DNA-AM過表達載體,設置陰性對照組和空白對照組。Western-blot分析自噬相關的蛋白LC3A/B和Beclin。共聚焦顯微鏡下觀察自噬小體的形成。結果:相對于癌旁組織,胃癌標本中AM的蛋白表達量和基因表達量顯著上升。表達量升高的臨床患者生存率明顯低于表達量不高的患者(Pvalue=0.0258)。AM及其受體CRLR、RAMP1、RAMP2、RAMP3在胃癌中的表達量比起臨近的癌旁組織均有不同程度的升高,按照免疫組化評價標準平均得分分別為9分、8分、6分、8分、8分。在胃癌患者中高表達的AM有更高的臨床分級(Pvalue=0.011)、更大的腫瘤體積(Pvalue=0.008)。轉染AM-si RNA穩(wěn)定的敲低AM后,流式細胞術檢測BGC-823細胞的凋亡率呈降低趨勢,劃痕實驗檢測BGC-823細胞的遷移能力下降,平板克隆增殖實驗檢測細胞的增殖能力降低。AM在穩(wěn)定敲低之后,BCL2表達量降低,BAX表達量升高,caspase3表達量未見明顯變化,cleaved-caspase3表達量升高。驗證JNK、P-JNK、AKT、P-AKT、PKA、P-PKA相關通路蛋白,P-AKT蛋白明顯降低。當AM蛋白被穩(wěn)定的敲低和過表達后,共聚焦顯微鏡顯示自噬小體沒有顯著改變。自噬相關蛋白,LC3A/B和Beclin沒有顯著改變。結論:AM及其受體CRLR、RAMP1、RAMP2、RAMP3在胃癌中是高表達的比臨近的癌旁組織,這一比例占到65%左右。同時生存分析顯示AM的表達量與生存時間成負相關。同時AM的表達量與腫瘤細胞的大小、腫瘤的分級和惡性程度的分級相關。當AM被穩(wěn)定的敲低之后,體外培養(yǎng)的胃癌細胞BGC-823增殖速度減慢、細胞遷移速率降低、細胞凋亡增加、細胞侵襲力減弱。這提示我們靶向敲低AM的表達后,可以抑制癌細胞的增殖和遷移速度,增加其凋亡率,進而降低胃癌的延進,增加胃癌患者生存時間。而調(diào)控機制的研究發(fā)現(xiàn),AM發(fā)揮其對細胞增殖遷移侵襲的影響最大可能是通過AKT信號通路。AM對胃癌細胞凋亡影響可能是激活第三條內(nèi)質網(wǎng)凋亡途徑,最終激活下游的凋亡執(zhí)行分子Caspase-3實現(xiàn)凋亡。本研究并沒有發(fā)現(xiàn)AM對于胃癌腫瘤細胞自噬的影響。腫瘤細胞基礎水平自噬率太低,共聚焦顯微鏡沒有檢測到明顯的自噬小體的改變。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of AM on gastric cancer cell proliferation , invasion , migration and apoptosis . The results showed that there was no significant change in the expression of AM and the expression of caspase - 3 in gastric cancer . AM and its receptors CRLR , RAMP1 , RAMP2 , RAMP3 are highly expressed in gastric cancer than adjacent adjacent tissues , which accounts for about 65 % .

【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：1677210