本文選題：食管鱗狀細(xì)胞癌　切入點(diǎn)：侵襲轉(zhuǎn)移　出處：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:1)建立不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能人食管鱗癌細(xì)胞亞系,用基因芯片篩選差異基因,建立食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)譜;2)驗(yàn)證部分差異基因在不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能食管鱗癌細(xì)胞和組織的表達(dá),探討HSP90α、Annexin A1和14-3-3β在新疆哈薩克族食管鱗癌的表達(dá)和病理意義;3)研究HSP90AA1沉默對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和機(jī)制。方法:1)采用Transwell侵襲小室對(duì)Eca109母系(Eca109-T0)進(jìn)行篩選,建立高侵襲轉(zhuǎn)移潛能食管鱗癌細(xì)胞亞系Eca109-T4;體、內(nèi)外比較Eca109-T0、Eca109-T4、CE81T-0和CE81T-4各系ESCC遷移和增殖能力;以Eca109-T0和Eca109-T4為對(duì)象,提取總RNA,分別用Cy5和Cy3熒光標(biāo)記成cDNA探針,與基因芯片Affymetrix Gene Chip?Human Genome U133 Plus 2.0 Arry雜交,篩選出不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能食管鱗癌差異表達(dá)基因;對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG聚類分析;2)采用qRT-PCR、Western blot和免疫組化驗(yàn)證部分差異基因表達(dá);在細(xì)胞水平驗(yàn)證基因(HSP90AA1、ANXA1、YWHAB、CXCR7、SDC2和TNFRSF10DmRNA)和蛋白(HSP90α、AnnexinA1、14-3-3β和CXCR7)表達(dá)差異:采用免疫組化驗(yàn)證蛋白(HSP90α、AnnexinA1和14-3-3β)在86對(duì)新疆哈薩克族食管鱗癌和癌旁組織中的表達(dá),分析各蛋白表達(dá)水平與浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、性別、年齡、大體類型、腫瘤位置和大小等臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;3)采用RNAi干擾技術(shù)下調(diào)CE81T-4細(xì)胞中HSP90AA1的表達(dá),綠色熒光、qRT-PCR及Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果,MTT法檢測(cè)CE81T-4細(xì)胞的增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡;劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力;Western blot檢測(cè)MET、MMP2、ERK和P-ERK蛋白的表達(dá)變化;qRT-PCR檢測(cè)MET和MMP2mRNA表達(dá)差異;復(fù)制裸鼠皮下移植瘤模型,觀察移植瘤增殖速度和瘤體重量。結(jié)果:1)Transwell小室篩選出Eca109-T4高侵襲轉(zhuǎn)移潛能人食管鱗癌細(xì)胞亞系,體內(nèi)外生物學(xué)特性比較結(jié)果:Eca109-T4、CE81T-4的增殖、遷移及體外成瘤能力均高于Eca109-T0和CE81T-0;Eca109-T4的遷移、浸潤(rùn)能力高于CE81T-4組;對(duì)Eca109-T0和Eca109-T4基因芯片檢測(cè),共篩選出326個(gè)差異基因,其中Eca109-T4組上調(diào)123個(gè),與Eca109-T0比較下調(diào)表達(dá)203個(gè);GO聚類分析顯示差異基因主要定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞液;分子功能涉及蛋白結(jié)合,金屬離子結(jié)合和DNA結(jié)合等;參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附等生物學(xué)過(guò)程;KEGG聚類分析顯示差異基因主要參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、mapk通路和癌癥通路等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;2)驗(yàn)證結(jié)果與基因芯片篩選結(jié)果基本一致,qrt-pcr檢測(cè):hsp90aa1、ywhab、cxcr7和sdc2mrna在eca109-t4、ce81t-4的表達(dá)高于在eca109-t0、ce81t-0的表達(dá)(p0.05);tnfrsf10dmrna在ce81t-4組低于在eca109-t4的表達(dá)(p0.05);annexina1在eca109-t0、ce81t-0的表達(dá)高于在eca109-t4、ce81t-4表達(dá)(p0.05);westernblot結(jié)果:hsp90α、14-3-3β、cxcr7蛋白在eca109-t0和ce81t-0低于在eca109-t4和ce81t-4的表達(dá)(p0.05),annexina1蛋白在eca109-t0、ce81t-0的表達(dá)高于在eca109-t4和ce81t-4的表達(dá)(p0.05);hsp90aa1mrna和hsp90α蛋白在ce81t-4表達(dá)高于在eca109-t4的表達(dá)(p0.05);免疫組化結(jié)果:hsp90α、14-3-3β在新疆哈薩克族食管鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于在癌旁組織的表達(dá)(87.2%㤘18.6%,80.23%㤘41.86%,p=0.000,0.0002),annexina1在食管鱗癌組織的表達(dá)低于在癌旁組織表達(dá)(32.6%㤘59.3%,p=0.0002);hsp90α與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(p=0.024、0.021、0.011),與患者性別、年齡、類型、位置和腫瘤大小無(wú)關(guān)(p0.05);annexina1與分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(p=0.037、0.014),與浸潤(rùn)深度、年齡、性別、類型、腫瘤大小和位置等其他病理參數(shù)無(wú)關(guān)(p0.05);14-3-3β表達(dá)與浸潤(rùn)深度和分化程度有關(guān)(p=0.008、0.035),與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、類型、位置和腫瘤大小無(wú)關(guān)(p0.05);3)hsp90aa1-rnai干擾ce81t-4細(xì)胞后可見(jiàn)到綠色熒光,hsp90aa1mrna和hsp90α蛋白在實(shí)驗(yàn)組(hsp90aa1-rnai)的表達(dá)低于陰性組對(duì)照組(nc-rnai)和正常培養(yǎng)組(nc)(p0.05),證實(shí)有效下調(diào)hsp90aa1表達(dá);mtt檢測(cè)0h和24h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組無(wú)差異(p0.05),在48h、72h和96hhsp90aa1-rnai組細(xì)胞增殖被抑制(p0.05);hsp90aa1-rnai組細(xì)胞周期阻滯于g0/g1期,hsp90aa1下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,凋亡率在hsp90aa1-rnai、nc-rnai和nc組分別為(27.30±4.33)%、(5.63±1.12)%、(10.20±2.04)%(p0.05);劃痕后24h、48h和72h各時(shí)間點(diǎn)hsp90aa1-rnai組細(xì)胞的遷移距離減小(p0.05);transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果:hsp90aa1-rnai組侵襲細(xì)胞數(shù)目降低(p0.05);westernblot檢測(cè)hsp90aa1-rnai組的met、mmp2和p-erk蛋白表達(dá)降低(p0.05),erk在各組表達(dá)無(wú)差異(p0.05);qrt-pcr檢測(cè)met、mmp2mrna在hsp90aa1-rnai組表達(dá)降低(p0.05);hsp90aa1-rnai組皮下移植瘤增殖速度慢,重量低(p0.05)。結(jié)論:1)建立的不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能食管鱗癌細(xì)胞株模型,為后續(xù)研究提供了模型;侵襲轉(zhuǎn)移差異基因表達(dá)譜的建立和生物信息學(xué)分析為深入轉(zhuǎn)移相關(guān)研究提供了豐富的信息;2)hsp90aa1、anxa1、ywhab、cxcr7和sdc2與食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān);hsp90α、14-3-3β在食管鱗癌高表達(dá),它們與浸潤(rùn)深度呈正相關(guān),與分化程度呈負(fù)相關(guān);hsp90α和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān);annexina1在食管鱗癌中低表達(dá),在分化程度高的,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌中Annexin A1表達(dá)上調(diào);HSP90α、Annexin A1及14-3-3β的表達(dá)可一定程度反映食管鱗癌的分化程度、侵襲深度和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,有望成為食管鱗癌早期診斷,預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移,侵襲和分化程度的分子標(biāo)志物;2)RNAi技術(shù)可有效抑制CE81T-4細(xì)胞中靶基因HSP90AA1表達(dá),HSP90AA1下調(diào)表達(dá)使CE81T-4細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,促進(jìn)凋亡,抑制增殖、侵襲和遷移能力,可能通過(guò)下調(diào)P-ERK、MET和MMP2機(jī)制介導(dǎo)的。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of HSP90AA1 ( HSP90偽 , AnnexinA1 and 14 - 3 - 3尾 ) in esophageal squamous cell carcinoma of Xinjiang , and to investigate the expression of HSP90偽 , AnnexinA1 and 14 - 3 - 3尾in esophageal squamous cell carcinoma of Xinjiang . The expression of HSP90AA1 in CE81T - 4 cells was regulated by using RNAi interference technique . The results showed that the expression of HSP90AA1 in CE81T - 4 cells was lower than that of CE81T - 4 . The results showed that the expression of Eca109 - T4 , CE81T - 4 was higher than that of CE81T - 4 . The expression of annexina1 in eca109 - t0 and ce81t - 0 was higher than that in eca109 - t4 and ce81t - 4 ( p0.05 ) ; the expression of annexina1 in eca109 - t0 and ce81t - 0 was higher than that in eca109 - t4 and ce81t - 4 ( p0.05 ) ; the expression of annexina1 in eca109 - t0 and ce81t - 0 was higher than that in eca109 - t4 and ce81t - 4 ( p0.05 ) ; It may be mediated by downregulating the P - ERK , MET , and MMP2 mechanisms .

【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1
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本文編號(hào)：1674632