本文選題：人上皮性卵巢癌　切入點(diǎn)：β-hCG　出處：《石河子大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:研究人絨毛膜促性腺激素β亞基(β-hCG)對(duì)上皮性卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。方法:1、攜帶目的基因β-hCG和報(bào)告基因GFP的慢病毒以及對(duì)照慢病毒分別感染上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3和ES-2,建立β-hCG穩(wěn)定過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞SKOV-3 lv-β-hCG和ES-2 lv-β-hCG以及對(duì)照組細(xì)胞SKOV-3 lv-con和ES-2 lv-con。qRT-PCR和western blot方法分別檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。采用單樣本t檢驗(yàn)分析過表達(dá)細(xì)胞株SKOV-3lv-β-hCG和ES-2 lv-β-hCG以及對(duì)照組細(xì)胞SKOV-3 lv-con和ES-2 lv-con之間β-hCG的表達(dá)差異。2、取4-6周齡雌性裸鼠,將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞SKOV-3 lv-β-hCG和ES-2 lv-β-hCG以及對(duì)照組細(xì)胞SKOV-3 lv-con和ES-2 lv-con,分別用胰島素針從裸鼠右下腹部移植入裸鼠腹腔,構(gòu)建腹腔移植瘤模型。每只裸鼠腹腔移植細(xì)胞數(shù)量為2×107個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞懸液總體積為200uL。每組實(shí)驗(yàn)裸鼠6只,共24只。術(shù)后未發(fā)生手術(shù)原因死亡,每隔3天觀察裸鼠一般狀態(tài),并記錄裸鼠體重變化。每周1次用活體成像系統(tǒng)觀察各組腫瘤細(xì)胞在裸鼠腹腔內(nèi)的成瘤及轉(zhuǎn)移情況。根據(jù)裸鼠狀態(tài)在腹腔移植術(shù)后第4-6周解剖裸鼠,全面解剖裸鼠盆腹腔臟器及胸腔雙肺組織,記錄腹水量及性狀;觀察并記錄腫瘤形成、形態(tài)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移情況,計(jì)算腹腔成瘤數(shù)(2mm);取部分組織液氮凍存?zhèn)溆?另一部分用中性甲醛固定、石蠟包埋后切片、HE染色鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)、組織學(xué)分型。western blot檢測(cè)兩組腫瘤的β-hCG表達(dá)情況,采用單樣本t檢驗(yàn)分析。兩組的腹水,體重,成瘤數(shù)以及轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)的對(duì)比用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、取4-6周齡雌性裸鼠,將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞SKOV-3 lv-β-hCG和ES-2 lv-β-hCG以及對(duì)照組細(xì)胞SKOV-3 lv-con和ES-2 lv-con,用顯微注射法在裸鼠一側(cè)卵巢進(jìn)行顯微多點(diǎn)注射,構(gòu)建卵巢原位移植瘤模型。每只裸鼠卵巢移植細(xì)胞數(shù)量為5×105個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞懸液總體積為5uL。每組實(shí)驗(yàn)裸鼠6只,共24只。術(shù)后未發(fā)生手術(shù)原因死亡,每隔3天觀察裸鼠一般狀態(tài),并記錄裸鼠體重變化。每周1次用活體成像系統(tǒng)觀察各組腫瘤細(xì)胞在裸鼠腹腔內(nèi)的成瘤及轉(zhuǎn)移情況。根據(jù)裸鼠狀態(tài)在原位移植術(shù)后第6周解剖裸鼠,全面解剖裸鼠盆腹腔臟器及胸腔雙肺組織,記錄腹水量及性狀;觀察并記錄腫瘤形成、形態(tài)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移情況,計(jì)算卵巢原位成瘤體積大小Volume=(長(zhǎng)徑×短徑2)/2,計(jì)算腹腔成瘤數(shù);留取裸鼠卵巢腫瘤組織,取部分組織液氮凍存?zhèn)溆?另一部分用中性甲醛固定、石蠟包埋后切片、HE染色鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)、組織學(xué)分型。western blot檢測(cè)兩組腫瘤的β-hCG表達(dá)情況,采用單樣本t檢驗(yàn)分析。兩組的裸鼠體重,卵巢原位成瘤體積大小以及轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)的對(duì)比用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、成功構(gòu)建β-hCG過表達(dá)的SKOV-3和ES-2細(xì)胞株倒置熒光顯微鏡下觀察,各組細(xì)胞的綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)效率約為95%。qRT-PCR檢測(cè)β-hCG的表達(dá)率,SKOV-3 lv-β-hCG比SKOV-3 lv-con提高了21283倍;ES-2 lv-β-hCG比ES-2 lv-con提高了72.33倍,統(tǒng)計(jì)結(jié)果均有顯著差異(P0.01)。western blot檢測(cè)β-hCG的表達(dá)水平,SKOV-3 lv-β-hCG比SKOV-3 lv-con提高了5.6倍;ES-2 lv-β-hCG比ES-2 lv-con提高了4.6倍,統(tǒng)計(jì)結(jié)果均有顯著差異(P0.01)。2、成功構(gòu)建了裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤動(dòng)物模型,并在此基礎(chǔ)上證實(shí)β-hCG促進(jìn)了裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。腹腔移植瘤術(shù)后裸鼠皮膚干燥,活動(dòng)明顯減少、消瘦、行動(dòng)遲緩、體重增加減緩以及腹水等惡病質(zhì)情況。借助活體成像系統(tǒng)計(jì)算各組熒光值,實(shí)驗(yàn)組SKOV-3 lv-β-hCG和ES-2 lv-β-hCG組均高于對(duì)照組SKOV-3 lv-con組和ES-2 lv-con組。其中,SKOV-3 lv-con組(46.88±8.23),SKOV-3 lv-β-hCG組(114.6±7.42),兩組熒光值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。ES-2 lv-con組(20.33±5.292),ES-2 lv-β-hCG組(79.81±4.05),兩組熒光值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。比較SKOV-3 lv-con組和SKOV-3 lv-β-hCG組裸鼠腹腔移植瘤模型后體重,兩組體重分別為SKOV-3 lv-con(18.61±0.54)和SKOV-3 lv-β-hCG(18.37±0.27),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。解剖裸鼠腹腔觀察,兩組腫瘤形成率均為100%。分別只有2只裸鼠有少量腹水形成,均為2/6。比較兩組腫瘤轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù),SKOV-3 lv-con(3.50±0.22)和SKOV-3lv-β-hCG(6.17±0.79),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。再比較兩組腫瘤形成個(gè)數(shù),SKOV-3lv-con(24.67±1.09)和SKOV-3 lv-β-hCG(48.17±3.75),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。比較ES-2 lv-con組和ES-2 lv-β-hCG組裸鼠腹腔移植瘤模型后體重,兩組體重分別為ES-2 lv-con(17.69±0.33)和ES-2 lv-β-hCG(17.83±0.51),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。解剖裸鼠腹腔觀察,兩組腫瘤形成率和腹水形成率均為100%,腹水呈乳糜樣。取腹水細(xì)胞涂片,行HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。測(cè)量比較兩組腹水體積,ES-2 lv-con組為(1.07±0.06)、ES-2 lv-β-hCG組為(1.09±0.05),兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較兩組腫瘤轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù),ES-2 lv-con(3.67±0.33)和ES-2 lv-β-hCG(6.33±0.92),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。再比較兩組腫瘤形成個(gè)數(shù),ES-2 lv-con(33.00±0.93)和ES-2 lv-β-hCG(58.33±2.50),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、成功構(gòu)建了卵巢癌裸鼠卵巢原位移植瘤動(dòng)物模型,并在此基礎(chǔ)上證實(shí)β-hCG促進(jìn)了裸鼠卵巢癌原位移植瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。卵巢原位移植瘤術(shù)后裸鼠出現(xiàn)皮膚干燥,活動(dòng)明顯減少、消瘦、行動(dòng)遲緩、體重增加減緩等惡病質(zhì)情況。借助活體成像系統(tǒng)計(jì)算各組熒光值,實(shí)驗(yàn)組SKOV-3 lv-β-hCG組和ES-2 lv-β-hCG組均高于對(duì)照組SKOV-3lv-con組和ES-2 lv-con組。其中,SKOV-3 lv-con組(42.18±16.14),SKOV-3 lv-β-hCG組(94.76±15.24),兩組熒光值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。ES-2 lv-con組(23.56±3.60),ES-2 lv-β-hCG組(97.04±8.26)。兩組熒光值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。比較SKOV-3 lv-con組和SKOV-3 lv-β-hCG組裸鼠原位移植瘤模型后體重,兩組體重分別為SKOV-3 lv-con(19.20±0.41)和SKOV-3 lv-β-hCG(18.94±0.26),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。解剖裸鼠腹腔觀察,兩組腫瘤形成率均為100%,均無腹水形成。比較兩組腫瘤轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù),SKOV-3 lv-con(2.33±0.21)和SKOV-3 lv-β-hCG(4.33±0.76),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。再比較兩組卵巢原位成瘤體積,SKOV-3 lv-con(2.57±0.25)和SKOV-3lv-β-hCG(2.93±0.32),兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較ES-2 lv-con組和ES-2 lv-β-hCG組裸鼠原位移植瘤模型后體重,兩組體重分別為ES-2 lv-con(18.04±0.24)和ES-2 lv-β-hCG(18.53±0.45),兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。解剖裸鼠腹腔觀察,兩組腫瘤形成率均為100%,分別有兩只裸鼠有少量透明腹水形成。比較兩組腫瘤轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù),ES-2 lv-con(2.50±0.22)和ES-2 lv-β-hCG(4.67±0.80),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。再比較兩組卵巢原位成瘤體積,ES-2 lv-con(2.56±0.25)和ES-2 lv-β-hCG(2.71±0.29),兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4、western blot檢測(cè)腹腔移植瘤模型中SKOV-3 lv-β-hCG組比SKOV-3 lv-con組提高了3.1倍;ES-2 lv-β-hCG組比ES-2 lv-con組提高了2.4倍。卵巢原位移植瘤模型中SKOV-3 lv-β-hCG組比SKOV-3 lv-con組提高了2.9倍;ES-2 lv-β-hCG組比ES-2 lv-con組提高了1.4倍,統(tǒng)計(jì)結(jié)果均有顯著差異(P0.01)。5、病理學(xué)檢測(cè)腹腔移植瘤模型及卵巢原位移植瘤模型的卵巢成瘤和各轉(zhuǎn)移灶組織行HE染色。顯微鏡觀察可見正常的卵巢上皮細(xì)胞已經(jīng)被腫瘤細(xì)胞替代,原位成瘤與轉(zhuǎn)移灶腫瘤成片塊狀彌漫分布或排列成團(tuán)狀,細(xì)胞核大且深染,細(xì)胞分化程度低。SKOV-3細(xì)胞模型構(gòu)建的卵巢和轉(zhuǎn)移瘤組織,HE染色觀察病理特征符合人卵巢漿液性腺癌;ES-2細(xì)胞模型構(gòu)建的卵巢和轉(zhuǎn)移瘤組織,HE染色觀察病理特征符合人卵巢透明細(xì)胞癌。結(jié)論:1、腹腔注射2×107個(gè)攜帶GFP的EOC細(xì)胞模型,可成功構(gòu)建可動(dòng)態(tài)檢測(cè)的裸鼠腹腔移植瘤模型,該模型能夠充分模擬卵巢癌腹腔播種移植的生物學(xué)特征,適宜作為研究人卵巢癌腹腔種植演變的體內(nèi)模型。2、異氟烷吸入麻醉、從背部正中縱切口進(jìn)入腹腔、顯微多點(diǎn)注射法移植攜帶GFP的EOC細(xì)胞模型,能成功構(gòu)建可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的裸鼠卵巢原位移植瘤動(dòng)物模型;該動(dòng)物模型與人卵巢癌生物學(xué)特征類似,適宜作為研究人卵巢癌演變進(jìn)展的體內(nèi)模型。3、β-hCG能促進(jìn)人上皮性卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 耿欣;劉彥芳;高玉梅;郭曉青;;β-HCG、ERK1/2及MMP-2在卵巢癌中的表達(dá)及意義[J];廣東醫(yī)學(xué);2015年09期

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本文編號(hào)：1672943