本文選題：腫瘤干細胞樣細胞　切入點：miR-183　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景非小細胞肺癌(NSCLC)目前是全球最常見的癌癥之一,早期遠處轉(zhuǎn)移是肺癌高死亡率的主要原因。越來越多的研究表明,腫瘤干細胞樣細胞(cancer stem-like cells,CSLCs)或腫瘤始動細胞(tumor initiating cells,TICs),具有較強的侵襲性,在惡性腫瘤局部浸潤和形成遠處器官轉(zhuǎn)移中起重要作用。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一組小型、內(nèi)源性非編碼RNAs,通過部分或完全綁定mRNAs3′-UTR區(qū)負性調(diào)控基因的表達。最新證據(jù)表明,miRNAs的異常表達與大量癌癥疾病中的腫瘤干細胞樣細胞失調(diào)密切相關(guān),例如miR-181與肝癌CSLCs,miR-34與胰腺癌CSLCs,miR-340與神經(jīng)膠質(zhì)瘤CSLCs,miR-125a與乳腺癌CSLCs,miR-17與卵巢癌CSLCs,miR-146a與結(jié)直腸癌CSLCs以及miR-320與前列腺癌CSLCs等等。課題組先前的研究顯示,miR-183可以調(diào)節(jié)NSCLC的侵襲性和增長。然而,miR-183的確切作用機制尚不清楚,是否通過調(diào)節(jié)CSLCs進而影響NSCLC的生物學行為,也不明確。因此,深入探討miR-183異常表達在CSLCs中的作用,將有助于認識NSCLC細胞浸潤、轉(zhuǎn)移的生物學行為及其潛在機制,為臨床病情監(jiān)測和防治提供新的思路。研究目的1.基于紫杉醇結(jié)合無血清培養(yǎng)獲取CD133+/CD326+A549CSLCs并驗證miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的表達。2.探討miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的作用。3.初步闡明miR-183調(diào)控CD133+/CD326+A549CSLCs侵襲轉(zhuǎn)移的機制。研究方法一.miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的表達1.通過課題組前期逆向誘導聯(lián)合藥物篩選富集肺腺癌始動細胞的實驗方法分離培養(yǎng)CD133+/CD326+A549CSLCs;應用流式熒光檢測技術(shù)檢測CD133+/CD326+A549CSLCS比例;進行激光共聚焦方法直觀觀測CD133和CD326分子標記在富集細胞中的表達。2.應用實時定量pcr技術(shù)檢測普通a549細胞和cd133+/cd326+a549cslcs中mir-183的表達情況。二.mir-183在cd133+/cd326+a549cslcs中的作用1.通過構(gòu)建mir-183慢病毒過表達和干擾載體,首先根據(jù)基因序列設計并合成互補oligodna,經(jīng)過退火、連接將目的片段連接至pcdna6.2-gw/emgfp質(zhì)粒上,經(jīng)過轉(zhuǎn)化后挑取3個克隆,搖菌抽提質(zhì)粒后進行測序,驗證pcdna6.2-gw/emgfp-mi-183重組克隆中插入片段序列與設計的寡聚單鏈dna序列一致;使用invitrogen公司的bp重組系統(tǒng)將目的片段重組到載體pdonr221上,從平板挑取陽性克隆并測序驗證,所得結(jié)果符合設計要求;最后用構(gòu)建的慢病毒表達載體和重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293t細胞,包裝病毒,組裝成plenti6.3-anti-mir-183,收集病毒原液,超速離心濃縮,并通過測定方法獲得病毒滴度。經(jīng)過測序結(jié)果顯示,我們成功構(gòu)建了plenti6.3-mir-183和plenti6.3-anti-mir-183慢病毒載體,并得到了較為準確的病毒滴度值,為后續(xù)實驗研究奠定了基礎(chǔ)。2.通過轉(zhuǎn)染實驗構(gòu)建mir-183過表達和干擾的cd133+/cd326+a549cslcs,實時定量pcr檢測mir-183在轉(zhuǎn)染慢病毒載體的cd133+/cd326+a549cslcs中的表達。3.裸鼠體內(nèi)成瘤實驗,并通過生物熒光技術(shù)檢測裸鼠肺部形成轉(zhuǎn)移瘤熒光強度;cck8檢測mir-183過表達組cd133+/cd326+a549cslcs增殖效應;體外transwell實驗檢測mir-183過表達或低表達的cd133+/cd326+a549cslcs的遷移和侵襲現(xiàn)象。三.mir-183調(diào)控cd133+/cd326+a549cslcs侵襲遷移的作用機制1.基于生物信息學預測分析平臺,預測mir-183下游靶點;雙熒光素酶基因報告載體系統(tǒng)間接驗證mir-183下游靶基因ptpn4;qrt-pcr和westernblot直接驗證經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染低表達mir-183的cd133+/cd326+a549cslcs中ptpn4基因和蛋白表達水平。2.構(gòu)建了ptpn4過表達質(zhì)粒,并設計mir-183過表達和ptpn4過表達共轉(zhuǎn)染cd133+/cd326+a549cslcs實驗,應用westernblot檢測了四組中ptpn4的蛋白表達水平;重復transwell侵襲實驗檢測了四組中侵襲的細胞數(shù)。3.結(jié)合臨床肺腺癌標本,應用qrt-pcr檢測組織標本中ptpn4基因的表達水平。研究結(jié)果1.mir-183在cd133+/cd326+a549cslcs中的表達顯著升高依據(jù)課題組前期逆向誘導聯(lián)合藥物篩選富集肺腺癌始動細胞的實驗方法,采用臨床用紫杉醇針劑(30mg/5ml),加藥濃度選定0.1μmol/l,加藥時間為48h;利用活細胞與細胞碎片的質(zhì)量差異采用rpm800轉(zhuǎn)進行離心,所得細胞克隆繼續(xù)無血清懸浮培養(yǎng),經(jīng)過兩周時間,細胞的活性能夠恢復如初,在體外可以連續(xù)傳代培養(yǎng),細胞大量成球生長,細胞膜圓潤完整,胞漿折光性好,隔天即可以傳代。流式熒光檢測技術(shù)可見富集的cd133+/cd326+a549cslcs比例在68%左右。激光共聚焦檢測,結(jié)果提示經(jīng)無血清培養(yǎng)傳代至第五代的a549成球細胞大量表達cd133/cd326分子。上述結(jié)果提示我們成功分離富集了cd133+/cd326+a549cslcs,根據(jù)課題組前期實驗基礎(chǔ),此類細胞可以作為a549細胞始動細胞進行后續(xù)實驗研究。實時定量pcr技術(shù)檢測普通a549細胞和cd133+/cd326+a549cslcs中mir-183的表達,發(fā)現(xiàn)cd133+/cd326+a549cslcs中mir-183表達較普通a549細胞顯著升高。2.mir-183促進cd133+/cd326+a549cslcs侵襲和遷移。為進一步研究mir-183在cd133+/cd326+a549cslcs中的作用,我們成功構(gòu)建了mir-183慢病毒過表達和干擾載體plenti6.3-mir-183和plenti6.3-anti-mir-183,我們將其轉(zhuǎn)染cd133+/cd326+a549cslcs,建立mir-183過表達和干擾的cd133+/cd326+a549cslcs,免疫熒光結(jié)果提示攜帶有g(shù)fp的慢病毒質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進cd133+/cd326+a549cslcs;經(jīng)實時定量pcr檢測mir-183在轉(zhuǎn)染慢病毒載體的cd133+/cd326+a549cslcs中的表達,plenti6.3-mir-183轉(zhuǎn)染組中mir-183較對照組顯著升高,而在plenti6.3-anti-mir-183轉(zhuǎn)染組中mir-183較對照組顯著降低,這一結(jié)果進一步證明我們轉(zhuǎn)染成功。由此我們獲得了穩(wěn)定表達mir-183和anti-183的cd133+/cd326+a549cslcs,這些細胞為我們隨后體內(nèi)、體外實驗研究mir-183在肺腺癌始動細胞中的作用提供了細胞支撐。結(jié)合課題組前期實驗數(shù)據(jù),我們進行了裸鼠體內(nèi)成瘤實驗,經(jīng)裸鼠尾靜脈注射plenti6.3-mir-183轉(zhuǎn)染的cd133+/cd326+a549cslcs,28天后經(jīng)生物熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)裸鼠肺部形成轉(zhuǎn)移瘤,且mir-183過表達組所形成的轉(zhuǎn)移瘤的熒光強度較對照組明顯增強;同時為排除cd133+/cd326+a549cslcs增殖所帶來的影響,我們用cck8對mir-183過表達組和對照組進行了檢測,結(jié)果顯示兩組無明顯差異;我們還進行了體外transwell實驗檢測了mir-183過表達或低表達的cd133/cd326雙陽性細胞的遷移和侵襲現(xiàn)象,發(fā)現(xiàn)mir-183過表達組較對照組產(chǎn)生遷移和侵襲的細胞數(shù)明顯增多,而mir-183低表達組則較對照組遷移及侵襲的細胞數(shù)明顯減少。體內(nèi)外結(jié)果均提示mir-183在cd133+/cd326+a549cslcs中發(fā)揮促侵襲和遷移的作用,表明mir-183可作為致癌基因促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。3.mir-183通過負調(diào)控ptpn4促進cd133+/cd326+a549cslcs侵襲作用我們利用targetscan、pictar、miranda等網(wǎng)絡mirna靶基因預測系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)mir-183潛在的下游靶點包括有癌基因、抑癌基因、細胞信號轉(zhuǎn)導分子,細胞周期調(diào)控基因和與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子,例如EGR1,PTPN4,ZEB1,PTEN和PDCD4等。我們利用雙熒光素酶基因報告載體系統(tǒng)將PTPN4野生型和突變型的3′-UTR區(qū)重組到pGL3質(zhì)粒載體上,然后和miR-183共轉(zhuǎn)染293T細胞,通過熒光活性檢測,野生型組熒光強度顯著降低,而突變組無明顯變化。隨后我們又通過在基因水平和蛋白水平直接檢測經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染低表達miR-183的CD133+/CD326+A549 CSLCS,PTPN4基因和蛋白表達水平較對照組明顯上升。間接實驗和直接實驗均驗證了PTPN4是miR-183下游靶點之一。我們構(gòu)建了PTPN4過表達載體,并設計了共轉(zhuǎn)染實驗,首先,我們應用western blot檢測了四組中PTPN4的蛋白表達水平,可見miR-control+PTPN4過表達組PTPN4較其他三組顯著上升,miR-183過表達+vector組較其他組明顯下降;其次我們利用上述四組細胞重復了Transwell侵襲實驗,細胞計數(shù)結(jié)果顯示miR-183過表達+vector組侵襲細胞數(shù)最多,與miR-control+vector組和miR-183過表達+PTPN4過表達組存在明顯差異,而miR-control+PTPN4過表達組發(fā)生侵襲的細胞數(shù)最少,較miR-control+vector組有顯著差異;最后我們對臨床肺腺癌標本檢測了miR-183和PTPN4基因的表達水平,發(fā)現(xiàn)無轉(zhuǎn)移標本的PTPN4基因表達較有轉(zhuǎn)移標本顯著降低;相關(guān)分析表明,在同一肺腺癌組織標本中miR-183表達水平與PTPN4mRNA表達水平呈顯著負相關(guān)。上述實驗結(jié)果提示,miR-183可以通過直接負調(diào)控下游靶基因PTPN4發(fā)揮促進CD133+/CD326+A549 CSLCS侵襲遷移的作用。研究結(jié)論miR-183可以通過綁定PTPN4的3′UTR區(qū)使其降解和抑制翻譯,從而達到抑制PTPN4的表達。CD133+/CD326+A549 CSLCs中miR-183高表達可以通過抑制PTPN4表達而促進CD133+/CD326+A549 CSLCs侵襲和遷移。
[Abstract]:The expression of miR - 183 in CD133 + / CD326 + A549CSLCs was studied . The expression level of ptpn4 gene and protein in the lung of nude mice were determined by means of biological fluorescence technique . The results showed that mir - 183 could be used as a cancer gene to promote invasion and metastasis of tumor .

【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1670529