本文選題：肝細(xì)胞癌　切入點：維甲酸-干擾素誘導(dǎo)死亡相關(guān)基因-19（GRIM-19）　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：背景及目的： 在全球范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)病率和死亡率均位居各種惡性腫瘤的前列。由于HCC起病隱匿、進(jìn)展快、轉(zhuǎn)移早、術(shù)后易復(fù)發(fā)，因此其早期診斷及臨床治療效果尚不理想。分子靶向藥物的臨床應(yīng)用為肝細(xì)胞癌患者，尤其是傳統(tǒng)治療失敗的患者帶來了希望，但是在實際臨床應(yīng)用中，仍存在某些不足如發(fā)生耐藥。究其原因，可能是由于HCC的發(fā)生發(fā)展過程比較復(fù)雜，常涉及多個基因、多個信號通路的改變。因此，闡明肝細(xì)胞癌的發(fā)病機制，尋找有效的分子治療靶標(biāo)已成為亟待解決的問題。 惡性腫瘤的發(fā)生多與原癌基因激活、抑癌基因失活以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路持續(xù)激活有關(guān)，其中維甲酸-干擾素誘導(dǎo)死亡相關(guān)基因-19（Gene associated with retinoid-interferon induced mortality-19，GRIM-19）是新近發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡、先天免疫及能量代謝等方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在多種人類惡性腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、胃癌及膠質(zhì)瘤中，GRIM-19發(fā)生突變、不表達(dá)或表達(dá)降低，并與這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，其機制可能是GRIM-19的異常導(dǎo)致了某些信號通路持續(xù)激活，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的周期、凋亡、轉(zhuǎn)移及代謝。然而，GRIM-19在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用研究較為少見。因此我們思考，GRIM-19在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用如何？上調(diào)GRIM-19的表達(dá)是否可通過調(diào)節(jié)相關(guān)的信號通路，影響肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、凋亡及轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制肝細(xì)胞癌的增殖及轉(zhuǎn)移？外源性導(dǎo)入GRIM-19能否有效地靶向治療肝細(xì)胞癌? 為了回答上述問題，，本研究首先觀察GRIM-19蛋白在人肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平，并分析其表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。進(jìn)而，以低表達(dá)GRIM-19的人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞為研究對象，通過重組慢病毒pLVX-Puro-GRIM-19-Myc質(zhì)粒感染SMMC-7721細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)GRIM-19的SMMC-7721細(xì)胞株，并在小鼠體內(nèi)構(gòu)建肝細(xì)胞癌原位移植瘤模型，以減毒沙門氏菌攜帶GRIM-19質(zhì)粒進(jìn)行靶向治療，觀察GRIM-19在體內(nèi)、體外對肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的影響，以及對與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)信號通路（PI3K/Akt信號通路和JAK/Stat信號通路）的影響。通過以上研究，揭示GRIM-19作為肝細(xì)胞癌治療潛在靶點的可行性，為肝細(xì)胞癌的分子靶向治療提供新的思路。 方法： （1）收集吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院手術(shù)切除的54例肝細(xì)胞癌及癌旁組織，懫用免疫組織化學(xué)染色（IHC）的方法，檢測GRIM-19蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)；采用NIH Image J形態(tài)學(xué)圖像分析軟件，對GRIM-19表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)及平均光密度進(jìn)行統(tǒng)計分析，比較GRIM-19蛋白表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。 （2）體外實驗部分：①采用慢病毒包裝GRIM-19質(zhì)粒，獲得重組慢病毒pLVX-Puro-GRIM-19-Myc質(zhì)粒，將其感染SMMC-7721細(xì)胞，通過氨芐抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)GRIM-19的肝癌細(xì)胞株；②采用RT-PCR和Western blot（WB）方法檢測穩(wěn)定表達(dá)GRIM-19的SMMC-7721細(xì)胞中，GRIM-19的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平；③采用MTT、PI單染流式細(xì)胞術(shù)、JC-1染色以及Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分別檢測過表達(dá)GRIM-19對SMMC-7721細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、線粒體膜電位以及凋亡的影響；④采用WB及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色（IFC）方法檢測過表達(dá)GRIM-19后，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（CDK4、PCNA、CyclinD1）、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9）、細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白（VEGF、MMP2、MMP9）以及與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)信號通路（PI3K/Akt信號通路和JAK/Stat信號通路）中關(guān)鍵蛋白（Akt1、p-Akt1、Stat3、p-Stat3）的表達(dá)。 （3）體內(nèi)實驗部分：①構(gòu)建C57BL/6近交系小鼠肝細(xì)胞癌原位移植瘤模型，以減毒沙門氏菌（phoP/phoQ突變株）攜帶GRIM-19質(zhì)粒，以灌胃方式給予肝細(xì)胞癌原位移植瘤模型鼠；②應(yīng)用小動物超聲影像系統(tǒng)檢測原位移植瘤體積的變化；③應(yīng)用PI單染流式細(xì)胞術(shù)、Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)以及TUNEL染色的方法，分別檢測原位移植瘤細(xì)胞周期及凋亡的變化；④應(yīng)用WB及IHC方法，檢測原位移植瘤中GRIM-19蛋白、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（CDK4、PCNA、Cyclin D1）、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9）、細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白（VEGF、MMP2、MMP9）以及與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)信號通路（PI3K/Akt信號通路、JAK/Stat信號通路）中關(guān)鍵蛋白（Akt1、p-Akt1、Stat3、p-Stat3）的表達(dá)。 結(jié)果： （1）與癌旁組織相比，GRIM-19蛋白在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平顯著降低，甚至缺失，在癌組織中GRIM-19蛋白平均光密度值（OD）為66.686±10.003，而癌旁組織中GRIM-19蛋白OD值為110.720±9.314，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。同時GRIM-19在癌組織中表達(dá)的陽性率為55.6%（30/54）且均為弱陽性，而在癌旁組織中表達(dá)的陽性率為100%(54/54)且以中等強度陽性和強陽性為主。 （2）GRIM-19蛋白在人肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平與患者年齡、性別、血清AFP水平、腫瘤直徑大小等臨床病理指標(biāo)無相關(guān)性；而與肝細(xì)胞癌組織的轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（P=0.022），與病理分級呈負(fù)相關(guān)（P=0.015），與AJCC TNM分期呈負(fù)相關(guān)（P=0.024）。 （3）體外實驗部分，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)GRIM-19的SMMC-7721細(xì)胞株。與對照組（SMMC-7721組）及空載質(zhì)粒組（EV組）相比，轉(zhuǎn)染GRIM-19組（GRIM-19組）肝癌細(xì)胞中GRIM-19的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平顯著增加；GRIM-19組肝癌細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞周期阻滯于G0-G1期，CDK4、PCNA及CyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào)；GRIM-19組細(xì)胞線粒體膜電位減弱，細(xì)胞凋亡比例增加，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax、Cytochrome C、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)上調(diào)；GRIM-19組肝癌細(xì)胞中VEGF、MMP2及MMP9蛋白表達(dá)下調(diào)；同時，GRIM-19組肝癌細(xì)胞中Akt1、p-Akt1、Stat3及p-Stat3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。 （4）體內(nèi)實驗部分，成功建立肝細(xì)胞癌原位移植瘤模型。給予重組減毒沙門氏菌GRIM-19質(zhì)粒治療后，與PBS組（Mock組）以及減毒沙門氏菌空載質(zhì)粒組（PQ-Scamble組）相比，肝細(xì)胞癌原位移植瘤組織中，減毒沙門氏菌GRIM-19組（PQ-GRIM-19組）GRIM-19蛋白表達(dá)增高；移植瘤生長減慢，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞周期阻滯于G0-G1期，腹腔轉(zhuǎn)移率及平均腹水量明顯降低，荷瘤小鼠生存率顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；且細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白以及相關(guān)信號傳導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白變化與體外細(xì)胞實驗一致。 結(jié)論： （1） GRIM-19蛋白在人肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)，與肝細(xì)胞癌組織的轉(zhuǎn)移、病理分級及AJCC TNM分期呈負(fù)相關(guān)，提示GRIM-19缺失可能參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展等過程。 （2）利用過表達(dá)GRIM-19的體內(nèi)外肝細(xì)胞癌模型，發(fā)現(xiàn)GRIM-19表達(dá)上調(diào)可使肝細(xì)胞癌的細(xì)胞周期阻滯、凋亡增加、以及轉(zhuǎn)移能力下降。提示GRIM-19表達(dá)上調(diào)可對肝細(xì)胞癌發(fā)揮抑瘤作用。 （3） GRIM-19可能通過負(fù)性調(diào)控PI3K/Akt信號通路及JAK/Stat信號通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而影響肝細(xì)胞癌的增殖及轉(zhuǎn)移，但其具體機制仍有待于進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 龔龍波;羅學(xué)來;劉雙又;陶德定;龔建平;胡俊波;;GRIM-19及其靶基因產(chǎn)物STAT3與結(jié)直腸癌惡性程度的關(guān)系[J];癌癥;2007年07期

2 周愛民;趙繼京;葉靜;肖衛(wèi)華;Dhananjaya V.KalvakolanU;劉榮玉;;GRIM-19蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J];癌癥;2009年04期

3 Li-Li Han;Yi Lv;Hui Guo;Zhi-Ping Ruan;Ke-Jun Nan;;Implications of biomarkers in human hepatocellular carcinoma pathogenesis and therapy[J];World Journal of Gastroenterology;2014年30期

4 Femke Heindryckx;P?r Gerwins;;Targeting the tumor stroma in hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Hepatology;2015年02期

本文編號：1665305