本文選題：HCC　切入點(diǎn)：TIPE1　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是人類最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率在人類腫瘤疾病中高居第三位,嚴(yán)重危害人類的健康。HCC致病機(jī)制的全面揭示將為制定完善的個(gè)體化治療方案提供理論依據(jù)。腫瘤壞死因子αα誘導(dǎo)蛋白 8(Tumor necrosis factor α-induced protein 8,TIPE)分子家族,包括 4個(gè)成員:TIPE、TIPE1、TIPE2和TIPE3,已被證實(shí)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、增殖、遷移等能力,參與炎癥、感染、自身免疫病、腫瘤等多種疾病的發(fā)展進(jìn)程。TIPE1基因位于人染色體19p13.3,編碼一個(gè)由188氨基酸組成的胞漿蛋白,在多種成年和胚胎組織中廣泛表達(dá)。TIPE1蛋白于2008年首次被鑒定為可同時(shí)調(diào)控細(xì)胞凋亡(apoptosis)和壞死狀凋亡(necroptosis)的候選分子。然而,迄今為止,對于TIPE1蛋白的具體生物學(xué)作用研究甚少。研究顯示,TIPE1可通過競爭性結(jié)合FBXW5,抑制TSC2降解,進(jìn)而負(fù)向調(diào)控mTOR活化,促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元自噬,可能參與帕金森病的發(fā)病過程。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞中TIPE1能夠抑制Rac1活化、促進(jìn)細(xì)胞死亡,進(jìn)而在肝癌進(jìn)程中發(fā)揮抑癌基因作用。然而,目前對于TIPE1在免疫調(diào)節(jié)方面的作用尚未見報(bào)道。實(shí)驗(yàn)室前期研究的結(jié)果提示,肝癌組織中免疫細(xì)胞高表達(dá)TIPE1,且具有巨噬細(xì)胞樣形態(tài)�；诖�,本課題擬研究腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage,TAM)中TIPE1蛋白的表達(dá)和功能,并初步探討其分子機(jī)制。研究目的本課題主要以肝癌為研究對象,探討TIPE1調(diào)控巨噬細(xì)胞活化和功能,參與腫瘤發(fā)生的作用機(jī)制,為肝癌的診治和預(yù)后評估尋找新靶點(diǎn)。具體研究目標(biāo)如下:1.檢測TIPE1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制;2.明確巨噬細(xì)胞TIPE1在肝癌發(fā)生中的生物學(xué)作用;3.初步探討TIPE1調(diào)控巨噬細(xì)胞活化和功能的分子機(jī)制。研究方法與結(jié)果1.免疫器官和巨噬細(xì)胞中可檢測到本底水平TIPE1表達(dá)目前對于免疫器官和免疫細(xì)胞中TIPE1表達(dá)情況尚未見有報(bào)道,因此本課題首先檢測了胸腺、脾臟、淋巴結(jié)等免疫器官中TIPE1的表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果顯示,胸腺、脾臟和淋巴結(jié)中可檢測到較高水平的TIPE1mRNA。因?yàn)?課題組前期免疫組化染色發(fā)現(xiàn),肝癌組織中具有巨噬細(xì)胞樣形態(tài)的細(xì)胞高表達(dá)TIPE1,因此本課題利用免疫熒光雙染檢測CD68+細(xì)胞TIPE1表達(dá)情況。結(jié)果顯示,胸腺、脾臟和淋巴結(jié)可檢測到大量TIPE1表達(dá)陽性細(xì)胞,部分CD68+細(xì)胞亦可檢測到TIPE1蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步明確TIPE1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況,分離小鼠6%淀粉誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓來源的巨噬細(xì)胞,RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,均可檢測到明顯的TIPE1 mRNA和蛋白的本底表達(dá)。免疫熒光染色結(jié)果亦顯示,人單核細(xì)胞系THP1中可檢測到TIPE1蛋白表達(dá)。以上結(jié)果提示,TIPE1蛋白在免疫器官和巨噬細(xì)胞中具有明顯的本底水平表達(dá)。2.肝癌組織中巨噬細(xì)胞TIPE1高表達(dá),且與患者生存期呈負(fù)相關(guān)采用免疫熒光雙染技術(shù)檢測TIPE1蛋白在人肝癌組織和相應(yīng)癌旁組織巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TIPE1可表達(dá)在部分CD68+巨噬細(xì)胞。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,肝癌組織中TIPE1+CD68+巨噬細(xì)胞比例顯著高于癌旁組織,且TIPE1+CD68+巨噬細(xì)胞比例與患者生存期顯著負(fù)相關(guān),結(jié)節(jié)型腫瘤中TIPE+CD68+巨噬細(xì)胞比例高于巨塊型腫瘤,但與腫瘤大小無明顯相關(guān)性。3.腫瘤微環(huán)境上調(diào)巨噬細(xì)胞中TIPE1表達(dá)為了在體外模擬腫瘤微環(huán)境,觀察其對巨噬細(xì)胞TIPE1表達(dá)的影響,我們用人肝癌細(xì)胞系HepG2,Huh7和小鼠肝癌細(xì)胞系H22細(xì)胞培養(yǎng)上清制備條件性培養(yǎng)基(hepatocellularcarcinoma Conditioned Medium,HCM)。分別設(shè)計(jì)不同的時(shí)間梯度(0,12,24,48h)和劑量梯度(0,100,200,300μl)作用于人單核細(xì)胞系THP1和小鼠原代巨噬細(xì)胞PM、BMDM,RT-PCR和Western Blot檢測TIPE1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,HCM可顯著上調(diào)THP1、PM、BMDM中TIPE1的表達(dá),且呈現(xiàn)明顯時(shí)間和劑量依賴性。4.TGF-β顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中TIPE1的表達(dá)TGF-β是腫瘤微環(huán)境中一個(gè)重要的細(xì)胞因子,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此,課題進(jìn)一步檢測了 TGF-β對巨噬細(xì)胞上TIPE1表達(dá)的影響,利用不同劑量TGF-β(0,2.5,5,10ng/ml)作用于人單核細(xì)胞系THP1、小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7和原代巨噬細(xì)胞PM等,RT-PCR和Western Blot檢測TIPE1表達(dá)。研究結(jié)果顯示,TGF-β可顯著增強(qiáng)THP1、RAW264.7和PM細(xì)胞中TIPE1mRNA和蛋白的表達(dá),且具有劑量依賴性。為進(jìn)一步明確TGF-β在腫瘤微環(huán)境上調(diào)TIPE1表達(dá)中的作用,我們還利用不同濃度梯度的TGF-β受體阻斷劑SB431542(0,2.5,5,10μg/ml)預(yù)處理腹腔巨噬細(xì)胞,之后再加入條件性培養(yǎng)基HCM刺激,檢測PM細(xì)胞上TIPE1的表達(dá)。結(jié)果顯示,SB431542可顯著抑制HCM誘導(dǎo)的PM中TIPE1表達(dá),且具有劑量依賴性。5.TIPE1可調(diào)控巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞的分化為進(jìn)一步探討巨噬細(xì)胞中T1PE1參與腫瘤發(fā)生的機(jī)制,同時(shí)考慮腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中以M2樣巨噬細(xì)胞為主,課題研究了 TIPE1在巨噬細(xì)胞活化和分化中的生物學(xué)作用。首先,分離小鼠6%淀粉誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞PM,分別利用LPS和IL-4誘導(dǎo)產(chǎn)生M1、M2型巨噬細(xì)胞,RT-PCR和Western Blot檢測TIPE1的表達(dá)。結(jié)果顯示,經(jīng)LPS刺激PM表達(dá)高水平iNOS,而Arg-1表達(dá)缺失;相反,經(jīng)IL-4刺激PM表達(dá)高水平Arg-1,IL-4刺激誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)TIPE1 mRNA和蛋白,顯著高于LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上,利用TIPE1小干擾敲減腹腔巨噬細(xì)胞PM和骨髓來源的巨噬細(xì)胞BMDM中TIPE1的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD206的表達(dá)和胞內(nèi)IL-10的產(chǎn)生。結(jié)果顯示,TIPE1干擾可顯著下調(diào)IL-4刺激后的巨噬細(xì)胞中CD206的表達(dá)和IL-10的產(chǎn)生。同時(shí),TIPE1小干擾尚可下調(diào)TGF-β和HCM刺激的BMDM細(xì)胞上清中IL-10的分泌水平。6.TIPE1調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)信號通路在上述研究基礎(chǔ)上,課題進(jìn)一步檢測了 TIPE1對巨噬細(xì)胞極化相關(guān)信號通路分子活化的影響。Western Blot結(jié)果顯示,TIPE1干擾可顯著下調(diào)IL-4刺激后的巨噬細(xì)胞中STAT6的表達(dá),而上調(diào)STAT1的表達(dá)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,轉(zhuǎn)錄因子STAT1/6則通過調(diào)控下游相關(guān)靶基因介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1/M2型極化。這提示TIPE1很有可能通過STAT1/STAT6信號通路參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化過程。7.巨噬細(xì)胞中TIPE1的表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長和遷移侵襲為了研究巨噬細(xì)胞中TIPE1表達(dá)的生物學(xué)功能,課題利用TIPE1干擾組或?qū)φ战M小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PM和骨髓來源巨噬細(xì)胞BMDM培養(yǎng)上清,分別刺激小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6細(xì)胞,CCK-8檢測其對腫瘤細(xì)胞生長能力的影響。結(jié)果顯示,與對照組上清相比,TIPE1干擾組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清可顯著抑制Hepa1-6細(xì)胞的生長能力。同時(shí),將TIPE1干擾組或?qū)φ战M巨噬細(xì)胞分別與Hepa1-6細(xì)胞共培養(yǎng),Transwell方法檢測Hepa1-6細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示,TIPE1干擾組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清可明顯抑制Hepa1-6細(xì)胞的遷移和侵襲能力。8.TIPE1通過影響巨噬細(xì)胞TGF-β分泌參與其促腫瘤活性為進(jìn)一步明確TIPE1調(diào)控巨噬細(xì)胞參與腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制,課題檢測了TIPE1對巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響。研究結(jié)果顯示,TIPE1干擾可顯著下調(diào)腹腔巨噬細(xì)胞PM和骨髓來源的巨噬細(xì)胞BMDM中TGF-β分泌水平。隨后,分別利用巨噬細(xì)胞特異性TGF-β敲除小鼠或野生型C57BL/6小鼠來源的BMDM與Hepa1-6細(xì)胞進(jìn)行Transwell共培養(yǎng),觀察TIPE1干擾對不同來源巨噬細(xì)胞促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示,TIPE1干擾可顯著抑制WT小鼠來源巨噬細(xì)胞的促腫瘤遷移能力,而對于TGF-β敲除小鼠來源巨噬細(xì)胞的促腫瘤遷移能力無明顯影響。研究結(jié)論根據(jù)上述研究結(jié)果,本課題初步明確了 TIPE1調(diào)控巨噬細(xì)胞參與腫瘤發(fā)生作用的分子機(jī)制,取得以下研究結(jié)論:1.TIPE1在多種免疫器官和巨噬細(xì)胞中具有本底水平的表達(dá)。2.腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞高表達(dá)TIPE1,且與患者生存期負(fù)相關(guān)。TGF-β在腫瘤微環(huán)境上調(diào)巨噬細(xì)胞TIPE1表達(dá)中發(fā)揮重要作用。3.TIPE1通過調(diào)控STAT1/STAT6磷酸化促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化。4.TIPE1可影響巨噬細(xì)胞TGF-β分泌進(jìn)而調(diào)控其促腫瘤活性。創(chuàng)新性和研究意義本課題率先系列檢測了 TIPE1在免疫器官和巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況,初步研究了 TIPE1調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化、細(xì)胞因子分泌進(jìn)而參與腫瘤發(fā)生的生物學(xué)作用,為揭示TIPE1生物學(xué)功能提供新數(shù)據(jù),為腫瘤免疫治療提供潛在的靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1664451