本文選題：HCC　切入點：TIPE1　出處：《山東大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是人類最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率在人類腫瘤疾病中高居第三位,嚴重危害人類的健康。HCC致病機制的全面揭示將為制定完善的個體化治療方案提供理論依據(jù)。腫瘤壞死因子αα誘導蛋白 8(Tumor necrosis factor α-induced protein 8,TIPE)分子家族,包括 4個成員:TIPE、TIPE1、TIPE2和TIPE3,已被證實通過調(diào)節(jié)細胞死亡、增殖、遷移等能力,參與炎癥、感染、自身免疫病、腫瘤等多種疾病的發(fā)展進程。TIPE1基因位于人染色體19p13.3,編碼一個由188氨基酸組成的胞漿蛋白,在多種成年和胚胎組織中廣泛表達。TIPE1蛋白于2008年首次被鑒定為可同時調(diào)控細胞凋亡(apoptosis)和壞死狀凋亡(necroptosis)的候選分子。然而,迄今為止,對于TIPE1蛋白的具體生物學作用研究甚少。研究顯示,TIPE1可通過競爭性結(jié)合FBXW5,抑制TSC2降解,進而負向調(diào)控mTOR活化,促進氧化應激誘導的多巴胺能神經(jīng)元自噬,可能參與帕金森病的發(fā)病過程。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn),肝細胞中TIPE1能夠抑制Rac1活化、促進細胞死亡,進而在肝癌進程中發(fā)揮抑癌基因作用。然而,目前對于TIPE1在免疫調(diào)節(jié)方面的作用尚未見報道。實驗室前期研究的結(jié)果提示,肝癌組織中免疫細胞高表達TIPE1,且具有巨噬細胞樣形態(tài)�；诖�,本課題擬研究腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage,TAM)中TIPE1蛋白的表達和功能,并初步探討其分子機制。研究目的本課題主要以肝癌為研究對象,探討TIPE1調(diào)控巨噬細胞活化和功能,參與腫瘤發(fā)生的作用機制,為肝癌的診治和預后評估尋找新靶點。具體研究目標如下:1.檢測TIPE1在巨噬細胞中的表達和調(diào)控機制;2.明確巨噬細胞TIPE1在肝癌發(fā)生中的生物學作用;3.初步探討TIPE1調(diào)控巨噬細胞活化和功能的分子機制。研究方法與結(jié)果1.免疫器官和巨噬細胞中可檢測到本底水平TIPE1表達目前對于免疫器官和免疫細胞中TIPE1表達情況尚未見有報道,因此本課題首先檢測了胸腺、脾臟、淋巴結(jié)等免疫器官中TIPE1的表達水平。RT-PCR結(jié)果顯示,胸腺、脾臟和淋巴結(jié)中可檢測到較高水平的TIPE1mRNA。因為,課題組前期免疫組化染色發(fā)現(xiàn),肝癌組織中具有巨噬細胞樣形態(tài)的細胞高表達TIPE1,因此本課題利用免疫熒光雙染檢測CD68+細胞TIPE1表達情況。結(jié)果顯示,胸腺、脾臟和淋巴結(jié)可檢測到大量TIPE1表達陽性細胞,部分CD68+細胞亦可檢測到TIPE1蛋白表達。為進一步明確TIPE1在巨噬細胞中的表達情況,分離小鼠6%淀粉誘導的腹腔巨噬細胞和骨髓來源的巨噬細胞,RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,均可檢測到明顯的TIPE1 mRNA和蛋白的本底表達。免疫熒光染色結(jié)果亦顯示,人單核細胞系THP1中可檢測到TIPE1蛋白表達。以上結(jié)果提示,TIPE1蛋白在免疫器官和巨噬細胞中具有明顯的本底水平表達。2.肝癌組織中巨噬細胞TIPE1高表達,且與患者生存期呈負相關采用免疫熒光雙染技術檢測TIPE1蛋白在人肝癌組織和相應癌旁組織巨噬細胞中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TIPE1可表達在部分CD68+巨噬細胞。進一步統(tǒng)計學分析顯示,肝癌組織中TIPE1+CD68+巨噬細胞比例顯著高于癌旁組織,且TIPE1+CD68+巨噬細胞比例與患者生存期顯著負相關,結(jié)節(jié)型腫瘤中TIPE+CD68+巨噬細胞比例高于巨塊型腫瘤,但與腫瘤大小無明顯相關性。3.腫瘤微環(huán)境上調(diào)巨噬細胞中TIPE1表達為了在體外模擬腫瘤微環(huán)境,觀察其對巨噬細胞TIPE1表達的影響,我們用人肝癌細胞系HepG2,Huh7和小鼠肝癌細胞系H22細胞培養(yǎng)上清制備條件性培養(yǎng)基(hepatocellularcarcinoma Conditioned Medium,HCM)。分別設計不同的時間梯度(0,12,24,48h)和劑量梯度(0,100,200,300μl)作用于人單核細胞系THP1和小鼠原代巨噬細胞PM、BMDM,RT-PCR和Western Blot檢測TIPE1的表達情況。結(jié)果顯示,HCM可顯著上調(diào)THP1、PM、BMDM中TIPE1的表達,且呈現(xiàn)明顯時間和劑量依賴性。4.TGF-β顯著增強巨噬細胞中TIPE1的表達TGF-β是腫瘤微環(huán)境中一個重要的細胞因子,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關重要的作用。因此,課題進一步檢測了 TGF-β對巨噬細胞上TIPE1表達的影響,利用不同劑量TGF-β(0,2.5,5,10ng/ml)作用于人單核細胞系THP1、小鼠巨噬細胞系RAW264.7和原代巨噬細胞PM等,RT-PCR和Western Blot檢測TIPE1表達。研究結(jié)果顯示,TGF-β可顯著增強THP1、RAW264.7和PM細胞中TIPE1mRNA和蛋白的表達,且具有劑量依賴性。為進一步明確TGF-β在腫瘤微環(huán)境上調(diào)TIPE1表達中的作用,我們還利用不同濃度梯度的TGF-β受體阻斷劑SB431542(0,2.5,5,10μg/ml)預處理腹腔巨噬細胞,之后再加入條件性培養(yǎng)基HCM刺激,檢測PM細胞上TIPE1的表達。結(jié)果顯示,SB431542可顯著抑制HCM誘導的PM中TIPE1表達,且具有劑量依賴性。5.TIPE1可調(diào)控巨噬細胞向M2型巨噬細胞的分化為進一步探討巨噬細胞中T1PE1參與腫瘤發(fā)生的機制,同時考慮腫瘤相關巨噬細胞中以M2樣巨噬細胞為主,課題研究了 TIPE1在巨噬細胞活化和分化中的生物學作用。首先,分離小鼠6%淀粉誘導的腹腔巨噬細胞PM,分別利用LPS和IL-4誘導產(chǎn)生M1、M2型巨噬細胞,RT-PCR和Western Blot檢測TIPE1的表達。結(jié)果顯示,經(jīng)LPS刺激PM表達高水平iNOS,而Arg-1表達缺失;相反,經(jīng)IL-4刺激PM表達高水平Arg-1,IL-4刺激誘導的M2型巨噬細胞高表達TIPE1 mRNA和蛋白,顯著高于LPS誘導的M1型巨噬細胞。在此基礎上,利用TIPE1小干擾敲減腹腔巨噬細胞PM和骨髓來源的巨噬細胞BMDM中TIPE1的表達,流式細胞術檢測M2型巨噬細胞表面標記分子CD206的表達和胞內(nèi)IL-10的產(chǎn)生。結(jié)果顯示,TIPE1干擾可顯著下調(diào)IL-4刺激后的巨噬細胞中CD206的表達和IL-10的產(chǎn)生。同時,TIPE1小干擾尚可下調(diào)TGF-β和HCM刺激的BMDM細胞上清中IL-10的分泌水平。6.TIPE1調(diào)節(jié)巨噬細胞極化相關信號通路在上述研究基礎上,課題進一步檢測了 TIPE1對巨噬細胞極化相關信號通路分子活化的影響。Western Blot結(jié)果顯示,TIPE1干擾可顯著下調(diào)IL-4刺激后的巨噬細胞中STAT6的表達,而上調(diào)STAT1的表達。相關文獻報道,轉(zhuǎn)錄因子STAT1/6則通過調(diào)控下游相關靶基因介導巨噬細胞向M1/M2型極化。這提示TIPE1很有可能通過STAT1/STAT6信號通路參與調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化過程。7.巨噬細胞中TIPE1的表達可促進肝癌細胞生長和遷移侵襲為了研究巨噬細胞中TIPE1表達的生物學功能,課題利用TIPE1干擾組或?qū)φ战M小鼠腹腔巨噬細胞PM和骨髓來源巨噬細胞BMDM培養(yǎng)上清,分別刺激小鼠肝癌細胞系Hepa1-6細胞,CCK-8檢測其對腫瘤細胞生長能力的影響。結(jié)果顯示,與對照組上清相比,TIPE1干擾組巨噬細胞培養(yǎng)上清可顯著抑制Hepa1-6細胞的生長能力。同時,將TIPE1干擾組或?qū)φ战M巨噬細胞分別與Hepa1-6細胞共培養(yǎng),Transwell方法檢測Hepa1-6細胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示,TIPE1干擾組巨噬細胞培養(yǎng)上清可明顯抑制Hepa1-6細胞的遷移和侵襲能力。8.TIPE1通過影響巨噬細胞TGF-β分泌參與其促腫瘤活性為進一步明確TIPE1調(diào)控巨噬細胞參與腫瘤發(fā)生的分子機制,課題檢測了TIPE1對巨噬細胞細胞因子分泌的影響。研究結(jié)果顯示,TIPE1干擾可顯著下調(diào)腹腔巨噬細胞PM和骨髓來源的巨噬細胞BMDM中TGF-β分泌水平。隨后,分別利用巨噬細胞特異性TGF-β敲除小鼠或野生型C57BL/6小鼠來源的BMDM與Hepa1-6細胞進行Transwell共培養(yǎng),觀察TIPE1干擾對不同來源巨噬細胞促進肝癌細胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示,TIPE1干擾可顯著抑制WT小鼠來源巨噬細胞的促腫瘤遷移能力,而對于TGF-β敲除小鼠來源巨噬細胞的促腫瘤遷移能力無明顯影響。研究結(jié)論根據(jù)上述研究結(jié)果,本課題初步明確了 TIPE1調(diào)控巨噬細胞參與腫瘤發(fā)生作用的分子機制,取得以下研究結(jié)論:1.TIPE1在多種免疫器官和巨噬細胞中具有本底水平的表達。2.腫瘤相關巨噬細胞高表達TIPE1,且與患者生存期負相關。TGF-β在腫瘤微環(huán)境上調(diào)巨噬細胞TIPE1表達中發(fā)揮重要作用。3.TIPE1通過調(diào)控STAT1/STAT6磷酸化促進巨噬細胞向M2型分化。4.TIPE1可影響巨噬細胞TGF-β分泌進而調(diào)控其促腫瘤活性。創(chuàng)新性和研究意義本課題率先系列檢測了 TIPE1在免疫器官和巨噬細胞中的表達情況,初步研究了 TIPE1調(diào)控腫瘤相關巨噬細胞極化、細胞因子分泌進而參與腫瘤發(fā)生的生物學作用,為揭示TIPE1生物學功能提供新數(shù)據(jù),為腫瘤免疫治療提供潛在的靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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