本文選題：前列腺癌　切入點：激素依賴性前列腺癌(ADPC)　出處：《東南大學》2017年博士論文

【摘要】：前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。在北美地區(qū)男性惡性腫瘤當中,前列腺癌的發(fā)病率最高并且死亡率僅次于肺癌。在我國,隨著人口老齡化的加劇,生活方式的西化,前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢,已成為威脅我國男性健康的主要疾病之一。前列腺癌的具體病因尚不完全清楚。普遍認為前列腺癌的形成是一個多因素多階段的過程。目前,前列腺癌根治性切除術是治療局限性前列腺癌的主要手段,但是對于已發(fā)生轉移或者術后復發(fā)的患者,通常采用內(nèi)分泌治療。研究表明,80%患者早期對雄激素剝奪治療敏感,但是在18-30個月的中位時間后,幾乎所有患者的病變都將逐漸發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)。這一階段的患者對于內(nèi)分泌治療以及放化療均不敏感,病情變得難以控制并且更容易出現(xiàn)轉移,進入了難以治愈的階段,已成為晚期前列腺癌患者主要的死亡原因。因此,探討前列腺癌的進展機制以及尋找新的分子生物治療靶點,對于延緩前列腺癌的惡性進展以及提高晚期腫瘤患者的生存率具有重要意義。近年來,microRNA (miRNA)在腫瘤中起到的作用受到了越來越多的關注。miRNA是一種單鏈的非編碼小分子RNA,由長度19-25個核苷酸構成。不同物種間的miRNA具有高度保守性,是調(diào)控基因表達的重要分子。成熟的miRNA通過堿基互補配對的方式與編碼基因的mRNA3'非編碼區(qū)(3'UTR),通過抑制轉錄起始或者降解mRNA的途徑,在轉錄后水平抑制靶基因的表達。至今為止,已發(fā)現(xiàn)的miRNA有數(shù)種,調(diào)控了人類基因組中大約一半的編碼基因,并且miRNA的表達水平異�；蚬δ芪蓙y密切影響了細胞的增殖、分化和凋亡以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。目前,越來越多的研究表明miRNA在前列腺癌的惡性進展中扮演著至關重要的作用。本課題組前期研究通過臨床相關性研究分析在激素依賴性前列腺癌患者標本與去勢抵抗性前列腺癌患者標本中表達顯著差異的miRNA,其中miR-744在去勢抵抗性前列腺癌中的顯著高表達,miR-744是一個最近被確定的腫瘤相關基因,在頭頸部相關腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、肝癌、鼻咽癌、卵巢癌、乳腺癌以及胰腺癌的患者組織中均發(fā)現(xiàn)其表達水平的異常。然而,目前還未見關于miR-744在人前列腺癌中研究報道�；谶@樣的研究現(xiàn)狀,本研究首先通過實時熒光定量PCR技術在前列腺癌的組織和細胞中驗證miR-744的表達水平,并且通過miR-744表達失調(diào)的體內(nèi)外功能實驗,探討miR-744在前列腺癌中的生物學功能。最后運用生物信息學和分子生物學相結合的手段以及結合熒光素酶報告基因?qū)嶒?進一步探究miR-744在前列腺癌中發(fā)揮生物學功能的分子機制。為篩選前列腺癌的生物標志物以及今后尋找新的前列腺癌治療靶點奠定堅實的理論基礎。第一部分miR-744在前列腺癌組織中的差異表達研究目的:隨著我國人口老齡化的加劇以及臨床診斷技術的進步,前列腺癌的發(fā)病率及檢出率呈逐年上升趨勢。前列腺癌早期大多為激素依賴性前列腺癌(ADPC),雄激素剝奪治療對大多數(shù)患者均有明顯效果,但一般在經(jīng)過14-30個月的中位時間后,幾乎所有患者最終均轉變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔?CRPC),這一階段的患者對內(nèi)分泌治療以及放化療均不敏感,進入了難以治愈的階段,并且疾病的進展十分迅速。目前,分子生物學方面的研究在臨床上已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)、診斷、治療前列腺癌惡性進展的熱點。miRNA在轉錄后翻譯水平調(diào)控編碼基因的表達,影響細胞的增殖、凋亡、分化以及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究方法:在前期研究中,課題組通過臨床收集16例ADPC組織與12例CRPC組織在液氮中保存,取3例ADPC組織與3例CRPC組織進行miRNAs表達譜芯片檢測分析。篩選差異表達的microRNA后,本部分研究通過實時熒光定量PCR (qRT-PCR)和原位雜交(ISH)分別在組織標本中予以驗證。同時,下載美國紀念斯隆凱瑟琳癌癥研究中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center, MSKCC)數(shù)據(jù)庫中前列腺癌患者的miRNA表達基因芯片數(shù)據(jù)后,利用統(tǒng)計學的方法分析差異表達的miRNA在前列腺癌中的診斷作用以及與預后生化復發(fā)的關系。研究結果:前期miRNA表達譜芯片檢測分析發(fā)現(xiàn)在ADPC與CRPC組織中存在顯著差異表達的miRNA,其中miR-744在惡性程度較高的CRPC組織中較ADPC顯著高表達。本部分研究并且通過qRT-PCR和ISH驗證了 miR-744在不同前列腺癌組織標本中的差異表達(P0.001)。同時,對MSKCC數(shù)據(jù)庫中下載的前列腺癌患者資料進行二次分析,Kaplan-Meier分析結果顯示在98例前列腺癌患者中,以中位數(shù)為截點將前列腺癌組分為miR-744高表達組和miR-744低表達組,miR-744高表達組的患者生化復發(fā)時間短(P0.0001)。并且通過多因素COX回歸分析得出miR-744是前列腺癌患者預后的獨立危險因素。研究結論:通過上述研究結果我們發(fā)現(xiàn)miR-744在CRPC中的表達較ADPC中顯著增高,隨著前列腺癌的惡性進展而升高,提示miR-744能夠用于診斷前列腺癌的惡性進展。第二部分miR744對前列腺癌細胞生物學功能的影響研究目的:前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素相互作用的復雜過程,涉及許多基因在不同時間節(jié)點的選擇性表達。在第一部分中,我們通過前期miRNA芯片表達譜分析并結合qRT-PCR以及ISH檢測驗證了 miR-744在CRPC組織中表達與ADPC組織中相比顯著升高,并且通過對國外數(shù)據(jù)庫中結果分析后得出miR-744前列腺癌的預后密切相關。但miR-744在人前列腺癌中的具體作用尚無系統(tǒng)的相關功能實驗驗證報道。因此,miR-744是否參與了前列腺癌的惡性進展,在前列腺癌由激素依賴向趨勢抵抗這一轉化過程中又扮演了怎樣的角色,在本部分研究中,我們通過體外細胞功能實驗以及體內(nèi)裸鼠皮下成瘤實驗,探討miR-744在激素依賴性前列腺癌細胞系以及去勢抵抗性前列腺癌細胞系中對細胞凋亡比例、細胞增殖能力、細胞遷移和侵襲能力以及裸鼠活體皮下成瘤能力的影響。研究方法:在激素依賴性前列腺癌細胞系(LNCAP)以及去勢抵抗性前列腺癌細胞系(PC3和DU145)中采用qRT-PCR實驗檢測miR-744的表達量。并且通過體外功能實驗在LNCAP、DU145和PC3細胞中分別過表達與干擾miR-744表達后,通過MTT和低密度細胞集落形成實驗檢測miR-744對前列腺癌細胞增殖能力的影響;流式細胞技術檢測miR-744對前列腺癌細胞凋亡能力的影響;Transwell小室實驗檢測miR-744對前列腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響。體內(nèi)實驗采用裸鼠皮下成瘤實驗進一步驗證miR-744對不同前列腺癌細胞系(LNCAP和PC3)體內(nèi)成瘤能力的影響,并通過ISH和免疫組化(IHC)檢測各組移植瘤體標本中miR-744以及Ki-67、CD31/34、Caspase-3等增殖凋亡以及血管生成相關基因的表達,進一步佐證miR-744對前列腺癌細胞增殖以及侵襲轉移能力的影響。研究結果:qRT-PCR實驗結果表明DU145和PC3細胞中的miR-744表達水平與LNCAP細胞相比顯著升高(P0.01)。MTT實驗和低密度細胞集落形成實驗結果均表明在miR-744表達量相對較低的LNCAP細胞中過表達miR-744后較對照組(NC組)相比能夠顯著促進細胞的增殖能力(P0.05)。流式細胞儀檢測結果發(fā)現(xiàn)過表達miR-744組與NC組相比能夠顯著降低LNCAP細胞凋亡的比例(P0.05)。在Transwell小室實驗中,過表達miR-744后能夠明顯促進LNCAP細胞的侵襲和遷移能力(P0.05)。裸鼠皮下成瘤實驗表明,過表達miR-744組的細胞瘤體大小和體積明顯大于對照組(P0.05),同時在皮下移植瘤體的病理切片中,免疫組化實驗結果表明細胞增殖相關基因Ki-67的表達顯著升高。同時,在miR-744表達量相對較高的DU145和PC3細胞中干擾miR-744的表達后,通過MTT實驗和低密度細胞集落形成實驗檢測發(fā)現(xiàn)miR-744低表達組中的細胞增殖能力相較NC組顯著降低。流式細胞儀檢測結果表明干擾miR-744表達后,DU145和PC3細胞凋亡的比例與NC組相比明顯升高。Transwell小室實驗檢測后發(fā)現(xiàn),低表達miR-744后,DU145和PC3細胞的侵襲和遷移能力與NC組相比受到明顯的抑制。裸鼠皮下成瘤實驗表明,干擾miR-744表達組的細胞瘤體大小和體積明顯小于對照組(P0.05),同時在皮下移植瘤體的病理切片中,免疫組化實驗結果表明細胞增殖相關基因Ki-67、血管生成影響因子CD31、CD34的表達均顯著降低,細胞凋亡相關基因caspase-3的表達明顯升高。研究結論:以上研究結果表明miR-744的高表達能夠促進前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力,并抑制細胞凋亡。相反的,干擾miR-744表達后,前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力受到明顯的抑制,細胞的凋亡比例升高。由此可以得出結論,miR-744在前列腺癌中發(fā)揮了促癌基因的作用。第三部分miR-744靶向NKD1激活WNT/β-catenin信號通路研究目的:從第二部分的體內(nèi)和體外實驗結果中我們發(fā)現(xiàn)miR-744的表達失調(diào)可以影響前列腺癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力,發(fā)揮促癌基因的作用。但是miR-744發(fā)揮作用的機制目前尚未清楚。如上文所述,miRNA通過堿基互補配對的方式與靶基因mRNA的3'UTR區(qū)域結合,降解mRNA或抑制mRNA的翻譯。因此,在明確了 miR-744的生物學特性之后,我們將著重探討miR-744發(fā)揮功能作用的分子生物學機制。研究方法:通過昂飛(Affymetrix)人類全基因組表達譜芯片技術結合miRNA靶基因預測分析軟件(miRNADA、TargetScan、RNA22-HSA),我們發(fā)現(xiàn)裸角質(zhì)蛋白同系物1 (NKD1)是miR-744在前列腺癌中的潛在靶基因,并且在細胞內(nèi)采用熒光素酶報告基因?qū)嶒炓约癢estern Blot實驗,以及在人前列腺癌和裸鼠皮下瘤體組織的標本內(nèi)利用ISH和IHC實驗同時驗證miR-744和NKD1之間的表達關系。通過KEGG通路分析芯片結果后發(fā)現(xiàn)miR-744表達失調(diào)后,WNT/β-catenin信號通路上的關鍵負向調(diào)控因子NKD1、GSK3β、SFRP1和TLE3在miR-744失調(diào)后均發(fā)生顯著差異表達,這表明miR-744在前列腺癌中可能通過調(diào)控WNT/β-catenin信號通路發(fā)揮其促進基因的作用,并且通過TOP/FOP實驗予以驗證。最后,我們通過功能學回復實驗,在細胞中進一步驗證miR-744對前列腺癌細胞增殖和侵襲的生物學功能是通過調(diào)控NKD1來實現(xiàn)的。研究結果:熒光素酶報告基因?qū)嶒炓约癢estern Blotting實驗研究結果均表明miR-744可直接與NKD1的3'UTR區(qū)域結合,抑制了 NKD1蛋白的表達(P0.05)。ISH以及IHC實驗結果發(fā)現(xiàn)在人體前列腺癌組織切片中以及裸鼠原位皮下移植瘤體組織切片中,miR-744與NKD1的表達呈顯著負相關。TOP/FOP實驗結果表明miR-744的表達失調(diào)能夠通過調(diào)控NKD1從而影響WNT/β-catenin信號通路的激活(P0.05)。通過功能學回復實驗,我們發(fā)現(xiàn)共轉染miR-744干擾片段和NKD1干擾質(zhì)粒后,細胞的增殖和侵襲能力相比較只干擾了 miR-744表達的實驗組而言顯著升高。上述實驗更進一步驗證了 miR-744與NKD1之間的靶向調(diào)控關系。研究結論:NKD1是miR-744的直接靶基因,miR-744靶向NKD1激活了 WNT/β-catenin信號通路,并且miR-744對前列腺癌生物學功能的影響是通過調(diào)控NKD1實現(xiàn)的。第四部分NKD1在前列腺癌中的功能學研究研究目的:在第三部分中,我們已經(jīng)證實了 miR-744在前列腺癌中可以直接靶向抑制NKD1的表達,并且通過抑制NKD1激活了 WNT/β-catenin信號通路,同時也進一步驗證了 miR-744對前列腺癌生物學功能的影響是通過調(diào)控NKD1實現(xiàn)的。并且通過IHC實驗結果檢發(fā)現(xiàn)NKD1在CRPC組織標本中的表達相對于ADPC顯著降低。目前關于NKD1在前列腺癌細胞中的表達情況以及其發(fā)揮的生物學功能還尚未見報道。因此,我們有必要檢測NKD1在前列腺癌細胞中的表達情況,并且進一步探究在前列腺癌中NKD1發(fā)揮的生物學功能。研究方法:在前列腺癌細胞系LNCAP、DU145和PC3中采用Western Blotting實驗檢測NKD1的差異表達。并且構建NKD1的過表達以及干擾質(zhì)粒,通過MTT和低密度細胞集落形成實驗檢測NKD1對前列腺癌細胞增殖能力的影響;Transwell小室實驗檢測NKD1對前列腺癌細胞侵襲能力的影響。研究結果:qRT-PCR和Western Blotting實驗結果表明DU145和PC3細胞中的NKD1表達水平與LNCAP細胞相比顯著降低(P0.01)。MTT實驗和低密度細胞集落形成實驗結果均表明在NKD1表達量相對較高的LNCAP細胞中干擾NKD1表達后較對照組(NC組)相比能夠顯著促進細胞的增殖能力(P0.05)。在Transwell小室實驗中,干擾NKD1表達后能夠明顯促進LNCAP細胞的侵襲和遷移能力(P0.05)。同時,在NKD1表達量相對較低的DU145和PC3細胞中過表達NKD1后,通過MTT實驗和低密度細胞集落形成實驗檢測發(fā)現(xiàn)NKD1過表達組中的細胞增殖能力相較NC組顯著降低(P0.05)。Transwell小室實驗檢測后發(fā)現(xiàn),過表達NKD1后,DU145和PC3細胞的侵襲能力與NC組相比受到明顯的抑制(P0.05)。研究結論:以上研究結果表明NKD1在前列腺癌細胞中的表達呈顯著差異,并且NKD1的表達失調(diào)對前列腺癌細胞產(chǎn)生了顯著的影響,由此得出,NKD1在前列腺癌中發(fā)揮了抑癌基因的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.25

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本文編號：1663899