發(fā)布時間：2018-03-25 12:11

  本文選題：miRNA　切入點：膠質瘤干細胞　出處：《南京醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：目的：惡性膠質瘤是人類顱內惡性程度最高的腫瘤之一,易復發(fā),難治愈,膠質瘤干細胞的存在被認為是其主要原因之一。近年來越來越多的研究表明miRNAs及其相關信號傳導通路和人類腫瘤干細胞的發(fā)生發(fā)展關系密切。其中特別是miR-125b與膠質瘤干細胞關系密切,其表達水平可調節(jié)膠質瘤干細胞增殖和凋亡的進程,但其作用的具體機制仍然不是十分明確。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是臨床一線抗膠質瘤藥物,而研究發(fā)現(xiàn)膠質瘤干細胞普遍對TMZ耐藥。但抑制miR-125b后可有效提高膠質瘤干細胞對TMZ的敏感性。新近有研究表明膠質瘤干細胞對TMZ的耐受可能與膠質瘤干細胞中PI3K/Akt,Bcl-2/caspase和高表達ABCG2蛋白等相關,而與膠質瘤細胞表達的06-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶(MGMT)無關。PI3K/Akt通路被抑制后發(fā)現(xiàn)對膠質瘤干細胞(GSCs)生物學特性的影響大于非膠質瘤干細胞(GSCs).而直接抑制Bcl-2表達或Bcl-2/caspase信號通路可誘導膠質瘤干細胞發(fā)生凋亡。ABCG2轉運蛋白是一種與腫瘤MDR有關的新的藥物泵,可把具有不同化學結構和作用于細胞內不同位置靶點的化療藥物泵出胞外,從而導致細胞抗藥性產生。脫甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin, DMC)被發(fā)現(xiàn)是ABCG2基因的一種有效的天然抑制劑,可有效抑制細胞內ABCG2表達。本課題旨在通過DMC抑制膠質瘤干細胞內ABCG2表達提高膠質瘤干細胞內TMZ濃度,進一步結合抑制膠質瘤干細胞miR-125b表達水平來提高膠質瘤干細胞對TMZ的敏感性,達到更好的抗膠質瘤干細胞效果,并探討其聯(lián)合作用的機制。通過此項研究為增強膠質瘤干細胞化療療效提供一定的理論與實踐基礎。方法：收集臨床不同等級的膠質瘤組織標本和腦外傷腦膨出需切除的正常腦組織,利用實時熒光定量PCR檢測miR-125b在不同等級膠質瘤組織與正常腦組織中的表達差異。從病理診斷WHO-IV級臨床膠質瘤母細胞瘤組織中分離培養(yǎng)原代膠質瘤細胞,然后利用免疫磁珠法分離出CD133陽性的膠質瘤干細胞,并通過Nestin和CD133免疫熒光染色驗證,建立原代膠質瘤干細胞體外培養(yǎng)及體內種植的模型。評價不同藥物濃度DMC對膠質瘤干細胞生長的抑制作用,研究其抗膠質瘤干細胞機理。進一步探討DMC聯(lián)合TMZ抗膠質瘤干細胞的作用及其機制。然后,合成上調和下調miR-125b的表達載體轉染膠質瘤干細胞,實時熒光定量PCR驗證轉染效果,進一步分析改變膠質瘤干細胞內miR-125b表達水平后,DMC或TMZ對膠質瘤干細胞增殖、凋亡作用的影響,分析相關信號通路的變化,找出調節(jié)的靶信號通路。最后,評價miR-125b抑制劑、TMZ和DMC三者聯(lián)合抗膠質瘤干細胞效果。結果：(1)miR-125b在正常腦組織中呈現(xiàn)過低表達,在WHO-Ⅱ、Ⅲ級膠質瘤組織中表達較正常腦組織僅輕度增高,但WHO-IV級膠質瘤組織中呈現(xiàn)明顯高表達,為正常腦組織數(shù)十倍以上,并在膠質瘤干細胞中也呈現(xiàn)過表達狀態(tài)。(2)我們在體外成功分離培養(yǎng)出原代膠質瘤干細胞,經(jīng)免疫組化鑒定為CD133和Nestin雙陽性。(3)DMC可有效抑制抑制膠質瘤干細胞增殖,并誘導其凋亡,作用效果明顯優(yōu)于TMZ,體外實驗表明兩者聯(lián)合使用有明顯的加強效應,但體內實驗結果顯示兩者聯(lián)合使用無明顯的疊加效應,體內DMC的抑瘤效果仍然明顯優(yōu)于TMZ。其作用與抑制JAK/STAT3通過活化有關。(4) miR-125b抑制劑和TMZ單獨并不能誘導膠質瘤干細胞凋亡,聯(lián)合miR-125b抑制劑和TMZ干預結果表明抑制miR-125b表達可促進TMZ誘導膠質瘤干細胞增殖抑制,并誘導其凋亡,其作用機制與miR-125b靶向BAK1基因,PI3K/AKT信號通路抑制相關等有關。(5)miR-125b可調節(jié)DMC對膠質瘤干細胞的敏感性,過表達的miR-125b可抵制DMC誘導膠質瘤干細胞凋亡的作用,其機制可能與miR-125b靶向調控BAK1表達有關。(6)miR-125b抑制劑聯(lián)合DMC聯(lián)合TMZ抗膠質瘤干細胞作用明顯優(yōu)于兩兩聯(lián)合組。結論：本研究結果證實抑制膠質瘤干細胞中miR-125b過表達可有效增敏TMZ和DMC的抗膠質瘤干細胞效果,并發(fā)現(xiàn)DMC抗膠質瘤干細胞效果無論體內外均明顯優(yōu)于TMZ。由此,我們提出通過靶向miRNA調控可能是增敏膠質瘤干細胞對化療藥物敏感性的一種新的途徑,為將來治療膠質瘤干細胞的提供了一個新的方向。
[Abstract]:Objective: malignant glioma is one of the most malignant tumors in human intracranial recurrence, difficult to cure, the presence of glioma stem cells is considered to be one of the main reasons. In recent years, more and more studies show that miRNAs and its related signal transduction pathway and human tumor stem cells had a close relationship. Especially miR-125b with glioma stem cells is closely related to its expression level can regulate glioma stem cell proliferation and apoptosis process, but the specific mechanism of the effect is still not very clear. Temozolomide (temozolomide, TMZ) is a clinical first-line anti glioma drugs, the study found that glioma stem cells are generally resistant to TMZ. But after the inhibition of miR-125b can effectively improve the sensitivity of glioma stem cells to TMZ. Recent studies have shown that glioma stem cells to TMZ tolerance and glioma stem cells in PI3K/Akt, Bcl-2/ caspase The high expression of ABCG2 and other related 06- methylguanine -DNA- expression and glioma cells and methyl transferase (MGMT) on glioma stem cells found by inhibiting irrelevant.PI3K/Akt pathway (GSCs) effect is greater than the non biological characteristics of glioma stem cells (GSCs). While the direct inhibition of the expression of Bcl-2 or Bcl-2/caspase signaling the cell apoptosis induced by.ABCG2 protein in glioma stem is a kind of new MDR associated with tumor drug pump, can have different chemical structure and function in cells in different position of target drug efflux pump outside cells, leading to cell resistance. Demethoxycurcumin (Demethoxycurcumin, DMC) is that is a kind of effective natural inhibitors of ABCG2 gene can effectively inhibit the expression of ABCG2 in cells. The purpose of this project is to inhibit the expression of ABCG2 in stem cells improve glioma stem cells in TMZ glioma by DMC With the further concentration, inhibition of stem cells to improve the expression level of miR-125b glioma stem cell sensitivity to TMZ glioma, better anti glioma stem cells, and to explore the mechanism of the combined effect. Through this research provided to enhance the theory and practice basis of glioma stem cells. Methods: the curative effect of chemotherapy collect the clinical grades of gliomas and brain injury encephalocele to normal brain tissue resection, differential expression using real-time fluorescence quantitative PCR detection of miR-125b in different grades of glioma and normal brain tissues. The cultured glioma cells from the pathological diagnosis of WHO-IV clinical glioma glioblastoma tissues. Then using immunomagnetic beads CD133 positive glioma stem cell separation method, and verified by Nestin staining and CD133 immunofluorescence, establish primary glioma stem cells in vitro Keep and in vivo model. Evaluation of different concentration DMC to inhibit the growth of glioma stem cells, to study the anti glioma stem cells. To further explore the mechanism of DMC and TMZ on anti glioma stem cells. Then the effect and mechanism of synthesis, up-regulated and down regulated miR-125b expression vector was transfected into glioma stem cells, real-time quantitative verification of PCR transfection effect, further analysis of changes in the expression level of miR-125b cells of glioma stem, DMC or TMZ on the proliferation of glioma stem cells, apoptotic effect, analysis of the changes of related signaling pathways, identify the target signal pathway. Finally, the evaluation of miR-125b inhibitors, TMZ and DMC three combined anti glioma stem the effect of cell. Results: (1) miR-125b showed low expression in normal brain, WHO- II, III grade glioma than normal brain tissues was slightly increased, but WHO-IV grade of glioma Obviously showed high expression in normal brain tissue as dozens of times, and in glioma stem cells also showed overexpression of state. (2) we successfully isolated in vitro cultured glioma stem cells, identified by immunohistochemistry for CD133 and Nestin double positive. (3) DMC can effectively the inhibition of the proliferation of glioma stem cells, and induce apoptosis, the effect is better than that of TMZ, in vitro experiments show that the combination use of strengthening effect is obvious, but the in vivo experiment results show that the combination use of superposition effect is obvious, the anti-tumor effect of DMC in vivo is still significantly better than TMZ. and its role in the inhibition of JAK/STAT3 activation by. (4) miR-125b and TMZ inhibitors alone did not induce apoptosis of glioma stem cells, combined with miR-125b inhibitor TMZ intervention and the results show that inhibition of the expression of miR-125b may promote TMZ induced glioma stem cell proliferation inhibition and induction The cell apoptosis and its mechanism of miR-125b targeting BAK1 gene, PI3K/AKT signaling pathway inhibition and so on. (5) miR-125b can regulate DMC on glioma stem cells sensitivity, overexpression of miR-125b can resist DMC induced glioma stem cells apoptosis, and its mechanism may be related to the regulation of BAK1 expression of miR-125b target. (6) miR-125b DMC combined with TMZ inhibitor combined with anti glioma stem cells was superior to that of 22 combined group. Conclusion: the results of this study confirmed that inhibition of stem cells in the expression of miR-125b TMZ and DMC can effectively sensitized the anti glioma effect of glioma stem cells, and found that DMC anti glioma stem cells both in vitro and in vivo this is significantly better than that of TMZ., we may put forward by targeting miRNA regulation is sensitizing glioma stem a new pathway of cell sensitivity to chemotherapy, for future treatment of glioma stem cells provides a new The direction.

【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 徐俊杰;于洪泉;國巍;趙偉;金宏;溫娜;齊玲;;西蘭花多肽對大鼠C6膠質瘤細胞生長的影響[J];中風與神經(jīng)疾病雜志;2012年11期

2 徐俊杰;于洪泉;趙偉;金宏;溫娜;齊玲;劉興吉;;西蘭花多肽對C6膠質瘤細胞的誘導凋亡作用[J];吉林大學學報(醫(yī)學版);2013年01期

3 仝海波,江澄川,唐鎮(zhèn)生,金一尊;膠質瘤細胞化學增敏作用實驗研究[J];山西臨床醫(yī)藥;2000年07期

4 李嗍,王楓,繆珊,駱文靜;過量鋅對鼠膠質瘤細胞體外生長的影響[J];解放軍預防醫(yī)學雜志;2001年04期

5 梁一鳴,郭國慶,鄭少俊,沈偉哉;膠質瘤血管內皮生長因子表達的調節(jié)[J];臨床與實驗病理學雜志;2001年02期

6 曲元明,韓韜,李桂林,王成偉;血管內皮細胞生長因子抗體對膠質瘤生長的影響[J];山東醫(yī)科大學學報;2001年02期

7 黃強,董軍;膠質瘤的分子外科治療[J];中國微侵襲神經(jīng)外科雜志;2001年04期

8 葉明,周岱,周幽心,王瑋,傅建新,黃煜倫;血管內皮生長因子在膠質瘤中的表達[J];腫瘤;2002年06期

9 顧宇翔,陳銜城,王宇倩;膠質瘤對親細胞非均質分子脂質和幾種藥物敏感性的比較[J];復旦學報(醫(yī)學版);2003年02期

10 王成偉 ,劉福生 ,曲元明 ,李桂林;血管內皮生長因子抗體抑制膠質瘤生長的實驗研究[J];中華神經(jīng)外科雜志;2003年01期

相關會議論文 前10條

1 李飛;李梅;盧佳友;朱剛;林江凱;孟輝;吳南;陳志;馮華;;脂質微區(qū)干擾劑甲基-β-環(huán)糊精影響C6膠質瘤細胞侵襲和遷移的體外實驗研究[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

2 吳安華;王運杰;Ohlfest JR;Wei Chen;Low WC;;膠質瘤的生物治療-從實驗室到臨床[A];中華醫(yī)學會神經(jīng)外科學分會第九次學術會議論文匯編[C];2010年

3 徐宏;韓楊云;孫中書;李新軍;;與膠質瘤代謝通路相關的候選基因篩選[A];中華醫(yī)學會神經(jīng)外科學分會第九次學術會議論文匯編[C];2010年

4 潘冬生;;多基因修飾膠質瘤細胞疫苗的抗腫瘤免疫反應[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第六屆全國代表大會論文匯編[C];2011年

5 俞文華;車志豪;張祖勇;許培源;陸鏞民;傅林;朱強;陳鋒;杜權;;骨橋蛋白在膠質瘤細胞中的表達及其信號傳導途徑[A];2005年浙江省神經(jīng)外科學術會議論文匯編[C];2005年

6 張震;徐克;;低強度超聲誘導C6膠質瘤細胞凋亡的體外實驗研究[A];中華醫(yī)學會第十三次全國超聲醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2013年

7 蔣偉峰;高方友;尹浩;;白細胞介素-17及其受體在膠質瘤中的表達及臨床意義[A];2013年貴州省神經(jīng)外科年會論文集[C];2013年

8 徐慶生;張小兵;周永慶;;膠質瘤干細胞及其放療敏感性[A];2011年浙江省神經(jīng)外科學學術年會論文匯編[C];2011年

9 楊孔賓;趙世光;劉炳學;陳曉豐;戴欽舜;;K~+通道阻斷劑四乙胺對大鼠膠質瘤細胞的增殖和凋亡影響[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

10 黃強;;膠質瘤生成細胞研究[A];第三屆中國腫瘤學術大會教育論文集[C];2004年

相關重要報紙文章 前5條

1 衣曉峰　馮宇曦;中藥三氧化二砷有望成為治療膠質瘤新藥[N];中國醫(yī)藥報;2011年

2 記者 匡遠深;讓膠質瘤干細胞不再“繁殖”[N];健康報;2011年

3 張獻懷　張文;瘤區(qū)埋雷 持續(xù)殺傷[N];健康報;2007年

4 白毅;人腦膠質瘤基礎與應用研究喜結“九大碩果”[N];中國醫(yī)藥報;2006年

5 王德江；劉藏；王貴懷；曹勇；王新生；肖新如;交流最新進展 提高診治水平[N];中國醫(yī)藥報;2005年

相關博士學位論文 前10條

1 董軍;CUL4B在神經(jīng)膠質細胞瘤中的作用研究[D];山東大學;2015年

2 張睿;循環(huán)miR-221/222在膠質瘤診斷與預后中的價值與基于CED的中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥新方法的研究[D];山東大學;2015年

3 許森林;ALDH1A1在膠質瘤侵襲和結直腸癌轉移中的作用和機制[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

4 王嘯;靶向嵌段共聚物膠束在膠質瘤磁共振成像、藥物輸送及治療的應用[D];安徽醫(yī)科大學;2015年

5 廖紅展;鋅指轉錄因子SNAI2在miR-203的影響下通過上皮間質轉化參與膠質瘤耐藥機制的調節(jié)[D];南方醫(yī)科大學;2015年

6 潘俊;IRG1促進膠質瘤增殖的作用機制及臨床意義[D];南方醫(yī)科大學;2015年

7 鄭傳宜;膠質瘤中GLUT3基因異常表達的意義及其相關調控機制[D];南方醫(yī)科大學;2015年

8 徐紅超;氬氦冷凍消融聯(lián)合GM-CSF治療膠質瘤小鼠的療效及其對小鼠脾臟樹突狀細胞免疫功能影響[D];南方醫(yī)科大學;2015年

9 黃素寧;TNFRSF6B在膠質瘤中的表達及對膠質瘤細胞增殖及凋亡的作用研究[D];南方醫(yī)科大學;2015年

10 熊偉;GBE1在人腦膠質細胞瘤中的表達及干預實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

相關碩士學位論文 前10條

1 張大慶;單核細胞趨化蛋白-1在骨髓間充質干細胞向膠質瘤細胞趨化中的作用研究[D];大連醫(yī)科大學;2012年

2 張靜文;T細胞過繼免疫治療小鼠腦膠質瘤原位模型的研究[D];河北醫(yī)科大學;2015年

3 洪宇;膠質瘤瘤周水腫、病理級別、Ki-67表達三者相關性研究[D];石河子大學;2015年

4 姬云翔;磷酸化Cx43蛋白在人膠質瘤細胞中表達及其與腫瘤細胞增殖相關性研究[D];石河子大學;2015年

5 朱峰;OPN的異常表達與膠質瘤的相關性研究[D];河北醫(yī)科大學;2015年

6 劉兵;SENP1表達水平對人腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展的作用機制及其相關性[D];河北醫(yī)科大學;2015年

7 李文華;Slit2/Robo1在人腦膠質瘤中的表達及臨床意義[D];河北醫(yī)科大學;2015年

8 楊睿;組蛋白去乙�；窰DAC9在膠質瘤細胞增殖中的作用及機制研究[D];西南大學;2015年

9 李鵬存;膠質瘤患者血漿中microRNAs的異常表達及臨床意義[D];天津醫(yī)科大學;2013年

10 梁英;三株海洋細菌抗膠質瘤活性成分的研究[D];浙江大學;2016年

，

本文編號：1663059