本文選題：土木香內酯　切入點：腫瘤治療　出處：《吉林大學》2016年博士論文

【摘要】：肺癌是目前世界范圍內最常見的惡性腫瘤,也是導致癌癥患者死亡的主要病因。根據組織學特點,肺癌可分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌,前者約占肺癌總數(shù)的85%。非小細胞肺癌又包括:腺癌、鱗癌和大細胞癌,其中腺癌和鱗癌為主要類型,其發(fā)病率分別為50%和30%。目前針對非小細胞肺癌的治療有很多方法,對于早期非小細胞肺癌患者,手術仍然是首選。但是由于絕大多數(shù)肺癌患者首次就診時就已經診斷為晚期,術后又有較高的復發(fā)率,因此術后輔助化療是預防其復發(fā)轉移的一種有效手段。目前被廣泛認可的治療方案是以鉑類為主的雙藥聯(lián)合化療。近年來,隨著分子生物的發(fā)展,大量研究發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌細胞中存在基因突變,這使得對于進展期非小細胞肺癌的治療不僅僅局限于化療,還可以根據已經測定的突變基因,進行靶向治療。近年來,中草藥在腫瘤治療方面的作用引起了全世界的關注。它以價錢低廉,儲備豐富,毒性低等優(yōu)點被廣泛用于癌癥治療,但是由于缺乏強有力的實驗室證據,并沒有引起全世界的重視。隨著實驗室技術和方法的進步,傳統(tǒng)中藥在全球癌癥治療領域發(fā)揮著越來越大的作用。關于中草藥在肺癌治療領域的研究也取得了很大的成果。土木香內酯是常見的倍半萜內酯類化合物,主要來源于云木香,旋覆花,土木香根等植物,經研究證實土木香內酯具有抗真菌,抗結核桿菌,抗炎,抗微生物,驅蟲等多種生物活性。其分子結構中的α-亞甲基-γ-內酯可能是其發(fā)揮作用的必需功能基。近年來發(fā)現(xiàn)土木香內酯對結腸癌,黑色素瘤,卵巢癌,前列腺癌和白血病細胞都具有抑制作用,但是土木香內酯對非小細胞肺癌的影響尚不明確。本研究擬通過觀察土木香內酯對非小細胞肺癌的影響,并探討其機制,為非小細胞肺癌的臨床治療提供新的途徑,也為土木香內酯臨床應用提供理論依據。我們選取肺鱗癌SK-MES-1細胞和肺腺癌A549細胞作為研究對象,通過MTT實驗,得到土木香內酯能夠抑制非小細胞肺癌細胞的生長,說明其具有抗腫瘤作用。根據以往的研究,凋亡在抗腫瘤藥物作用機制中發(fā)揮重要作用。因此為了探討土木香內酯抑制非小細胞肺癌增殖的原因,本研究對土木香內酯作用下的非小細胞肺癌細胞進行凋亡檢測,檢測結果發(fā)現(xiàn)土木香內酯能夠誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡,并隨著濃度的增加,凋亡細胞明顯增加。我們同時對SK-MES-1細胞進行周期分布的檢測,檢測結果顯示,土木香內酯能夠改變細胞的周期分布,使分布在G1/G0期的細胞增多,提示土木香內酯能夠使SK-MES-1細胞阻滯在G1/G0期。凋亡的作用機制復雜,由多重信號通路和蛋白參與。為了進一步探討土木香內酯誘導凋亡的機制,我們對凋亡相關的信號通路和蛋白進行檢測。caspases家族蛋白是凋亡的重要調控者,無論是外源性凋亡途徑,還是內源性凋亡途徑,都有caspases的參與。根據目前的研究結果我們得出,caspase-8是啟動死亡受體途徑的關鍵caspase。線粒體凋亡主要是激活caspase-9。我們的實驗結果顯示在土木香內酯的作用下,caspase-8,caspase-9均被裂解,其下游的靶分子caspase-3和PARP也同樣觀察到裂解產物。說明土木香內酯誘導的凋亡途徑是雙重的,可能通過使細胞內死亡受體配體表達增加和改變線粒體功能促進凋亡發(fā)生。線粒體是細胞內重要的細胞器,是細胞內能量代謝的重要場所,也是誘導凋亡發(fā)生的蛋白質作用的主要部位。線粒體膜電位(MMP)是體現(xiàn)線粒體功能的指標。MMP異常是導致凋亡的重要原因。因此我們通過流式細胞儀檢測細胞內MMP的水平,結果發(fā)現(xiàn)在兩種細胞中,MMP水平都下降,和對照組相比有明顯的差異,說明在這兩種細胞中都存在著線粒體功能的障礙,這可能是導致凋亡的重要原因。MMP的變化主要是由于線粒體膜通透性改變,當線粒體通透性轉化孔(permeability transition pore,PTP)開放時,線粒體膜去極化,使MMP降低,而這一過程主要受Bcl-2家族蛋白調控。Bcl-2家族蛋白可以分為促凋亡蛋白,以Bax為代表;和抑凋亡蛋白,以Bcl-2為代表。當內源性的刺激信號傳來時,分布于細胞漿中的Bax形成二聚體插到線粒體外膜上,破壞線粒體外膜的完整性,從而降低MMP,誘發(fā)凋亡。分布于線粒體外膜上的Bcl-2對凋亡起抑制作用。它能夠通過自身特定的化學結構結合促凋亡蛋白特定的促凋亡結構域,從而抑制促凋亡蛋白活性,保護線粒體膜的穩(wěn)定性,達到抑制凋亡的作用。也有研究表明Bcl-2能夠與凋亡酶激活因子-1(apoptosis protease-activating factor 1,Apaf-1)結合,阻滯凋亡小體(apoptosome)的形成,而凋亡小體使凋亡得以進行的關鍵。本研究結果顯示土木香內酯作用于NSCLC后,細胞內的的Bcl-2表達下降,而Bax表達增加,說明Bcl-2家族參與了土木香內酯引起的MMP降低。ROS是細胞內級聯(lián)反應的重要調控者。細胞內過多的ROS能夠誘發(fā)氧化應激,影響B(tài)cl-2蛋白家族表達進而通過內源性途徑導致凋亡發(fā)生。ROS還參與細胞內脂質過氧化反應和蛋白質巰基交聯(lián)反應。這些反應都能夠使線粒體膜通透性轉化孔開放。有研究也表明土木香內酯能夠通過使細胞內ROS水平升高誘導凋亡。為了進一步探討土木香內酯的作用機制,本研究對NSCLC細胞內的ROS進行檢測結果發(fā)現(xiàn)土木香內酯能夠升高細胞內的ROS水平,提示ROS可能是其介導凋亡的始動因素。ROS增多的原因有待進一步研究。ROS對細胞周期也有一定的調控作用。它能夠影響周期進程的多個方面,例如:周期過程中的信號傳導通路,介導周期相關蛋白降解的泛素化反應以及構成細胞支架的肌動蛋白活性等。有研究結果顯示ROS能夠介導細胞發(fā)生G1期阻滯,能夠使G1期相關周期調控蛋白cyclin D表達減少,使抑制周期進程的p21表達增加,這和我們的研究結果相同,提示土木香內酯介導的SK-MES-1細胞G1/G0期阻滯可能跟細胞內ROS水平升高有關。通過本研究我們可以發(fā)現(xiàn)土木香內酯能夠通過誘導凋亡和周期阻滯抑制SK-MES-1細胞增殖,在凋亡過程中,內源性和外源性途徑都被激活,ROS增加,Bcl-2家族蛋白表達發(fā)生改變,引起MMP降低,是內源性凋亡途徑激活的原因,同時ROS增加,引起相應的周期相關蛋白表達發(fā)生改變,可能是造成周期阻滯的原因。在A549細胞中,土木香內酯的增殖抑制作用主要是通過改變Bcl-2家族蛋白的表達,引起MMP降低,誘發(fā)凋亡發(fā)生來完成的。綜上所述,土木香內酯能夠抑制NSCLC的增殖,是一個潛在的可研發(fā)的抗腫瘤藥物,本研究為其臨床應用提供一定的理論基礎。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1661849