本文選題：PRR11　切入點(diǎn)：β-catenin　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景和目的乳腺癌是世界范圍女性最常見的惡性腫瘤,占女性全部惡性腫瘤的22%左右,是危害女性健康的最主要的疾病之一[1]。乳腺癌曾經(jīng)在中國等發(fā)展中國家發(fā)病率較低,然而隨著社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境等諸多因素的變化,乳腺癌的發(fā)病率在全球范圍迅速增加,僅僅10年時(shí)間乳腺癌的總發(fā)病率提高了近10倍[2],乳腺癌在中國更是以每年2.7%的比例快速增長[3]。流行病學(xué)資料顯示,基因的異常擴(kuò)增和突變及遺傳易感性改變?cè)谌橄侔┑陌l(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用[4]。近年來隨著對(duì)一些重要癌基因和抑癌基因生物學(xué)功能的不斷深入研究,乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制被逐漸闡釋[4]�；谛碌陌┗蚝湍[瘤靶標(biāo)的靶向治療也在乳腺癌的治療中發(fā)揮了重要作用,隨著分子分型及腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出,乳腺癌的研究正逐步從以往的循證治療、經(jīng)驗(yàn)治療向新的以全基因組測(cè)序和基因突變?yōu)閷?dǎo)向的個(gè)體化治療轉(zhuǎn)變,在這個(gè)大環(huán)境下,探索新的乳腺癌關(guān)鍵癌基因,發(fā)現(xiàn)其新的調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)作用,并實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化正成為近年來乳腺癌研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。盡管乳腺癌的診斷和治療取得了一些進(jìn)展,由于乳腺癌術(shù)后的遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移特性致使乳腺癌患者預(yù)后仍然不良,更好的認(rèn)識(shí)乳腺癌的發(fā)病及進(jìn)展的分子機(jī)制,挖掘乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移侵襲過程中的標(biāo)志性癌基因?qū)τ陂_發(fā)出治療轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)性乳腺癌患者的新策略尤為重要。國內(nèi)外已有研究表明,PRR11在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。富含脯氨酸蛋白PRR11(Proline-rich protein 11)基因位于人類染色體17q22區(qū),生物信息學(xué)分析顯示PRR11包含1個(gè)二聯(lián)核定位信號(hào),2個(gè)脯氨酸富集區(qū)域,和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。脯氨酸富集基序可以和SH3域相連接,調(diào)節(jié)蛋白與蛋白之間的相互作用,參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),引起一系列腫瘤相關(guān)事件;鋅指結(jié)構(gòu)域通過與雙鏈DNA結(jié)合,調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。該蛋白的作用靶標(biāo)可能為膜蛋白受體、粘附分子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、啟動(dòng)子等與腫瘤產(chǎn)生、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白及基因位點(diǎn)[5]。在之前的研究中,PRR11被認(rèn)為是影響腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié)的一個(gè)不利因素,但是它的作用以及對(duì)人實(shí)體瘤的臨床應(yīng)用價(jià)值卻鮮為人知。最近研究中,免疫組化技術(shù)被用來評(píng)估PRR11在6種胃腸腫瘤中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)PRR11的表達(dá)對(duì)肝門部膽管癌(HC)患者的臨床病情有重要影響[6]。PRR11的表達(dá)情況亦在肺癌中被報(bào)道,研究人員發(fā)現(xiàn)PRR11在蛋白水平的表達(dá)與肺癌細(xì)胞周期的進(jìn)展密切相關(guān)。在超過一半的肺癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了PRR11的過表達(dá)[7]。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)PRR11在實(shí)體瘤中有著廣泛的表達(dá),其中在食管鱗癌表達(dá)率最高占93.3%,肝癌最低占53.3%。這一結(jié)果證實(shí)此前關(guān)于PRR11在肺鱗癌高表達(dá)的研究是正確的[8]。通過對(duì)5種消化系統(tǒng)腫瘤中(食管鱗狀上皮細(xì)胞癌,胃癌,十二指腸癌,結(jié)直腸癌及肝癌)對(duì)PRR11的表達(dá)分析顯示,PRR11表達(dá)在五中腫瘤中有很明顯的改變,同時(shí)發(fā)現(xiàn)PRR11與胃癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。另據(jù)報(bào)道,Ji Ying等人發(fā)現(xiàn)PRR11在細(xì)胞周期進(jìn)展和腫瘤發(fā)生中起重要作用,這個(gè)蛋白因其致癌性被看作是肺癌診斷治療的一個(gè)潛在的新靶點(diǎn)[9]。通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期及腫瘤發(fā)生相關(guān)的重要基因,PRR11參與了肺癌發(fā)生的起始與發(fā)病進(jìn)程,也參與了乳腺癌上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)型。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal Transition,EMT)最早在1982年由Greenberg和Hay提出[10],是指在特定的生理和病理情況下上皮細(xì)胞通過一系列改變向間充質(zhì)細(xì)胞分化的現(xiàn)象,具體表現(xiàn)為上皮細(xì)胞喪失極性并獲得間質(zhì)表型,細(xì)胞間的連接及黏附能力下降或消失,細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移侵襲能力增加,細(xì)胞形態(tài)改變,以及細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平的變化,如?-連環(huán)素(β-catenin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)下調(diào),波形蛋白(vimentin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、?-SMA等間質(zhì)表型標(biāo)志物表達(dá)增加等。EMT在胚胎發(fā)育、組織發(fā)生中發(fā)揮重要作用,并存在于多種慢性疾病的發(fā)病過程及腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程中。調(diào)控細(xì)胞EMT發(fā)生的分子機(jī)制比較復(fù)雜并涉及多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,目前已報(bào)道的通路主要有TGF-?(14)BMP通路、PI3-K/Akt通路、Wnt/β-catenin通路、Src通路及整合素通路等[11-13]。但是誘發(fā)EMT并調(diào)控相關(guān)通路的關(guān)鍵基因及其作用機(jī)制尚不明確,有待于進(jìn)一步闡明。研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌細(xì)胞來源于乳腺上皮細(xì)胞,能夠表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物,且存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象;亦有報(bào)道稱在乳腺癌細(xì)胞系中上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin)可以顯著提高乳腺癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移能力,并與乳腺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。上述研究均提示EMT乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后過程中發(fā)揮著重要的作用。在我們的前期研究中通過對(duì)過度表達(dá)或干擾PRR11的乳腺癌MCF-7細(xì)胞系及其對(duì)照細(xì)胞系蛋白和基因水平的檢測(cè)表明,PRR11與?-catenin表達(dá)呈正相關(guān),提示我們PRR11在乳腺癌細(xì)胞系中可能正向調(diào)控Wnt/?-catenin通路,介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT,進(jìn)而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移能力,并影響乳腺癌患者的預(yù)后。乳腺癌是對(duì)女性健康威脅最大的腫瘤之一,至今其調(diào)控機(jī)制仍不十分清楚,除了ER/PR、HER2、Ki67外尚,可用于臨床診斷的預(yù)后標(biāo)志物及治療方面有效的分子靶點(diǎn)還很缺乏。因此尋找乳腺癌治療靶標(biāo)和預(yù)后標(biāo)志物是目前乳腺癌研究的重要內(nèi)容。PRR11作為一個(gè)重要的腫瘤相關(guān)信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白,其對(duì)乳腺癌及生長轉(zhuǎn)移的調(diào)控尚無報(bào)道。本課題將利用多種特征性乳腺癌細(xì)胞模型、腫瘤轉(zhuǎn)移模型系統(tǒng)研究PRR11在乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移中的作用,揭示其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移的調(diào)控及分子機(jī)制,并利用大規(guī)模乳腺癌樣本及其臨床病理資料和隨訪信息,系統(tǒng)分析PRR11與乳腺癌臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系,探討PRR11作為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物的應(yīng)用前景,最終為乳腺癌的診斷和治療提供新的靶標(biāo)。第一部分PRR11在乳腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)及其臨床意義目的:檢測(cè)PRR11在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá),分析PRR11表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性,探討其預(yù)后預(yù)測(cè)意義。方法:采用免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡檢測(cè)PRR11在乳腺癌細(xì)胞MCF-7、SK-BR3、MDA-MB-231和正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)乳腺癌組織與正常組織中PRR11的表達(dá)差異,明確乳腺癌組織中PRR11的表達(dá)與腫瘤分期、增殖指數(shù)、組織分級(jí)、分子分型等臨床病理特征的相關(guān)性。通過生存分析和Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型探討PRR11對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)意義。結(jié)果:免疫熒光顯示PRR11主要表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞漿內(nèi)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡結(jié)果提示,PRR11的m RNA和蛋白質(zhì)在乳腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于正常乳腺組織和上皮細(xì)胞系。免疫組化結(jié)果顯示,PRR11高表達(dá)的乳腺癌組織中增殖標(biāo)志物Ki67的表達(dá)明顯高于PRR11低表達(dá)的乳腺癌組織,PRR11的表達(dá)隨著乳腺癌分期的提高而增加。PRR11的表達(dá)與腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理分期、孕激素受體狀態(tài)密切相關(guān),但與年齡和淋巴結(jié)狀態(tài)無明顯相關(guān)性。生存分析提示,PRR11高表達(dá)患者生存期較低表達(dá)者明顯縮短,PRR11可作為乳腺癌患者獨(dú)立的不良預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。結(jié)論:PRR11在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于乳腺正常組織和上皮細(xì)胞,乳腺癌組織中PRR11表達(dá)與增殖指數(shù)、是否轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān),其可作為PRR11可作為乳腺癌患者獨(dú)立的不良預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。第二部分PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響目的:探討PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響方法:構(gòu)建慢病毒體介導(dǎo)的PRR11過表達(dá)和沉默體系,實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中PRR11表達(dá)的穩(wěn)定上下調(diào)。采用MTT、Ed U、平板克隆和TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。篩選PRR11穩(wěn)定上調(diào)和沉默的乳腺癌MCF-7細(xì)胞及各自對(duì)照細(xì)胞,構(gòu)建裸鼠皮下種植瘤模型,檢測(cè)PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)體內(nèi)腫瘤生長的影響。結(jié)果:細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PRR11過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞活力、Ed U陽性細(xì)胞百分比和平板克隆形成數(shù)目較對(duì)照組明顯升高,PRR11表達(dá)下調(diào)后乳腺癌細(xì)胞的上述生物學(xué)行為較對(duì)照組明顯受到抑制,且細(xì)胞凋亡數(shù)目較對(duì)照組明顯增多。荷瘤裸鼠模型結(jié)果顯示,PRR11表達(dá)上調(diào)后MCF-7細(xì)胞的成瘤體積、質(zhì)量和Ki67的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高,PRR11表達(dá)下調(diào)后上述指標(biāo)較對(duì)照組明顯降低。結(jié)論:PRR11表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和體內(nèi)成瘤能力;PRR11表達(dá)下調(diào)則會(huì)抑制乳腺癌增殖和體內(nèi)成瘤,并可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。第三部分PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響目的:探討PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響方法:采用慢病毒體介導(dǎo)的PRR11過表達(dá)和沉默體系,實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中PRR11表達(dá)的穩(wěn)定上下調(diào)。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。檢測(cè)PRR11表達(dá)上調(diào)后乳腺癌MCF-7細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)志物(E-cadherin、Fibronectin和Vimentin)的改變。結(jié)果:PRR11表達(dá)上調(diào)后,乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞劃痕愈合率和侵襲數(shù)量較對(duì)照組顯著提高,PRR11表達(dá)下調(diào)則會(huì)抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。PRR11表達(dá)上調(diào)后MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMT改變,E-cadherin表達(dá)降低,Fibronectin和Vimentin表達(dá)升高。結(jié)論:PRR11表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,PRR11表達(dá)下調(diào)則會(huì)抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。第四部分PRR11調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制目的:探討PRR11調(diào)控乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制方法:選取MCF-7細(xì)胞,采用免疫印跡和熒光定量PCR檢測(cè)PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)β-catenin及其下游信號(hào)分子cyclin D1、c-myc、E-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(TOP/FOP-flash)檢測(cè)對(duì)PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)β-catenin作為轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。采用小干擾RNA下調(diào)β-catenin的表達(dá)后,免疫印跡和熒光定量PCR檢測(cè)β-catenin及其下游信號(hào)分子表達(dá)變化,TOP/FOP-flash檢測(cè)β-catenin的轉(zhuǎn)錄因子活性,同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖和侵襲變化,驗(yàn)證PRR11通過β-catenin通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。采用免疫組化檢測(cè)臨床乳腺癌標(biāo)本中的PRR11和β-catenin表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:PRR11表達(dá)上調(diào)后,乳腺癌MCF-7細(xì)胞中β-catenin的總表達(dá)量和核內(nèi)表達(dá)量均明顯升高,其調(diào)控的下游基因cyclin D1、c-myc、E-cadherin和Vimentin表達(dá)也較對(duì)照組升高,受β-catenin轉(zhuǎn)錄激活的質(zhì)粒熒光強(qiáng)度(TOP/FOP)明顯增強(qiáng)。反之,當(dāng)PRR11表達(dá)下調(diào)后,上述分子的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低。當(dāng)同時(shí)下調(diào)β-catenin的表達(dá)后,PRR11上調(diào)所引發(fā)的cyclin D1、c-myc和Vimentin表達(dá)增加被抵消,而E-cadherin表達(dá)則有所恢復(fù)。此外,PRR11上調(diào)所引起的TOP/FOP比值升高也被抵消,MTT和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,β-catenin表達(dá)下調(diào)可以抵消PRR11過表達(dá)所引起的MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲能力的增強(qiáng)。臨床乳腺癌組織中PRR11和β-catenin的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.457,p0.001)。結(jié)論:PRR11通過與β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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