本文選題：非小細(xì)胞肺癌　切入點(diǎn)：表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景肺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤,占惡性腫瘤死亡原因的第一位。目前,我國每年新發(fā)肺癌約50萬,到2025年預(yù)計(jì)每年將有100萬新發(fā)肺癌患者,近30年來,我國肺癌死亡率上升了 465%,嚴(yán)重威脅著人民群眾的健康和生命。非小細(xì)胞肺癌(non-small celllung cancer,NSCLC)是肺癌的主要病理類型,約占肺癌的85%～90%。與小細(xì)胞肺癌相比,NSCLC的生長較為緩慢,轉(zhuǎn)移較晚,但診斷時(shí)可手術(shù)切除的病例僅占15～18%,術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的機(jī)率很高,以順鉑為基礎(chǔ)的雙藥聯(lián)合化療的緩解率僅30%左右,化療在改善晚期NSCLC患者的生存期方面的作用十分有限。因此整體而言,NSCLC病人的預(yù)后不佳。隨著對肺癌分子分型的研究進(jìn)展,NSCLC的治療已邁入精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代,表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)是其中研究最廣泛并已廣泛應(yīng)用到臨床的靶向基因之一·。在NSCLC患者中,EGFR突變主要發(fā)生在胞內(nèi)段編碼結(jié)構(gòu)域(外顯子18-21),包括外顯子19的缺失突變(delE746-A750)和外顯子21的點(diǎn)突變(L858R),這些突變使NSCLC對表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)的敏感性增加,稱作增敏EGFR突變,占所有EGFR突變的90%以上,高達(dá)50%的亞洲NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)這些增敏EGFR突變。EGFR-TKI使晚期NSCLC的治療從標(biāo)準(zhǔn)含鉑雙藥的化療時(shí)代進(jìn)入靶向治療時(shí)代,以吉非替尼和厄洛替尼為代表的第一代EGFR-TKI已成為EGFR敏感突變陽性患者的一線首選治療藥物。多個(gè)大規(guī)模的臨床試驗(yàn)已證明EGFR敏感突變陽性患者可從EGFR-TKI一線治療中獲益,然而耐藥問題始終如影隨形,多數(shù)存在增敏EGFR突變的NSCLC患者在約8～16個(gè)月治療后對吉非替尼產(chǎn)生耐藥性,對于EGFR-TKI耐藥機(jī)制的探索已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。NSCLC對EGFR-TKI的分子耐藥機(jī)制包括EGFR20外顯子T790M突變、MET基因擴(kuò)增、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)、向小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化和 EGFR 通路的旁路激活等,其中以20外顯子T790M突變最為常見。肺癌耐藥的另一種機(jī)制是獲得腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)表型,通過多能性轉(zhuǎn)錄因子(如Oct4,Sox2和Nanog)的表達(dá)介導(dǎo)。CSC,又稱腫瘤干細(xì)胞、癌干細(xì)胞,是指具有干細(xì)胞特性的小部分癌細(xì)胞,即具有"自我復(fù)制"以及"多向分化"能力的癌細(xì)胞。CSC被認(rèn)為是腫瘤克隆的發(fā)生核心,代表驅(qū)動(dòng)腫瘤生長和進(jìn)展的細(xì)胞群體,它是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥復(fù)發(fā)的根源。多項(xiàng)研究表明肺癌中具有高致瘤性、多潛能、可自我更新、高耐藥的CSC的存在。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)是胚胎干細(xì)胞維持自我更新及分化潛能的最重要的轉(zhuǎn)錄因子,也是胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物。Oct4在人體多種實(shí)體腫瘤中呈過表達(dá),并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。Oct4高表達(dá)患者的疾病進(jìn)展快、易轉(zhuǎn)移并預(yù)后差。使用人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞系和患者的原發(fā)性肺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn),盡管CSC有不同的表型,但其均表達(dá)多潛能干細(xì)胞基因,尤其是Oct4,Sox2和Nanog,可以作為CSC的標(biāo)志物。Oct4與腫瘤干細(xì)胞的多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)表型相關(guān),在惡性腫瘤化療耐藥的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,這使Oct4可能成為癌癥治療的重要靶標(biāo),特別是針對具有化療抗性的腫瘤類型,然而,很少有研究涉及Oct4在腫瘤靶向藥物的耐藥過程中所起的作用。有研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因CCSP-rtTA/TetO-EGFR(L858R/T790M)誘導(dǎo)EGFR突變吉非替尼耐藥的小鼠肺組織中Oct4和Sox2表達(dá)增加。然而,調(diào)節(jié)CSC在吉非替尼耐藥性中的分子機(jī)制尚未完全澄清。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and ac-tivator oftranscription3,STAT3)是高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,正常情況下參與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的調(diào)控,在惡性腫瘤中也與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤血管的發(fā)生及腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸等有關(guān),并通過調(diào)節(jié)干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)參與維持干細(xì)胞表型和多能性。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員,survivin基因啟動(dòng)子上含有STAT3的結(jié)合位點(diǎn)。STAT3途徑也參與肺癌的發(fā)生,STAT3的激活是NSCLC對EGFR-TKI耐藥的內(nèi)在機(jī)制,Oct4是否在STAT3/survivin信號(hào)途徑中發(fā)揮作用尚少研究。對Oct4在NSCLC中的表達(dá)及其對吉非替尼耐藥性影響的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究能夠更好的闡明肺癌耐藥的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制,從而采取針對性的治療策略以期進(jìn)一步提高EGFR突變肺癌患者的靶向藥物治療的有效率和持久性。目的探討Oct4 mRNA和蛋白在NSCLC患者腫瘤組織的表達(dá)及其與患者臨床病理特征的相關(guān)性,應(yīng)用Oct4-siRNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建特異性沉默Oct4基因表達(dá)的PC-9和PC-9/GR細(xì)胞系,探討Oct4在NSCLC中對腫瘤細(xì)胞增殖和吉非替尼獲得性耐藥的作用及其可能的信號(hào)通路。方法(1)Oct4在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及意義86例NSCLC患者肺癌組織樣本(NSCLC組)及其相應(yīng)癌旁正常組織樣本(對照組)。采用熒光定量PCR法、免疫組化法以及western blot法分別檢測上述組織樣本中Oct4 mRNA和蛋白的表達(dá),分析其表達(dá)與患者臨床病理特征包括年齡、性別、吸煙指數(shù)、腫塊大小、分化程度、TNM分期及病理類型等的相關(guān)性。(2)Oct4在非小細(xì)胞肺癌增殖及對吉非替尼耐藥中的作用選擇含有EGFR外顯子19缺失突變的人肺癌細(xì)胞系PC-9及吉非替尼獲得性耐藥的細(xì)胞系PC-9/GR作為研究對象,采用熒光定量PCR法和western blot法分別檢測PC-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞中Oct4 mRNA和蛋白的表達(dá)。應(yīng)用Oct4-siRNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建特異性沉默Oct4基因表達(dá)的PC-9和PC-9/GR細(xì)胞系,分為四組:Con-siRNAPC-9 細(xì)胞組(轉(zhuǎn)染 Con-siRNA)、Oct4-siRNAPC-9 細(xì)胞組(轉(zhuǎn)染 Oct4-siRNA)、Con-siRNAPC-9/GR 細(xì)胞組(轉(zhuǎn)染 Con-siRNA)和Oct4-siRNA PC-9/GR 細(xì)胞組(轉(zhuǎn)染 Oct4-siRNA)。Western blot 法檢測抑制Oct4基因表達(dá)后人肺癌PC-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞中Oct4蛋白的表達(dá)情況,MTT法檢測PC-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h時(shí)的增殖活性。然后將PC-9和PC-9/G R細(xì)胞各分為4組:Con-siRNA組(轉(zhuǎn)染Con-si RN A)、Con-siRNA+Gefitnib 組(2.5μM 吉非替尼 + 轉(zhuǎn)染 Con-siRNA)、Oct4-siRNA組(轉(zhuǎn)染 Oct4-siRNA)和 Oct4-siRNA+Gefitnib 組(2.5μM 吉非替尼 + 轉(zhuǎn)染Oct4-siRNA),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測上述各組細(xì)胞的凋亡率。(3)OCT4對非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的機(jī)制研究Western blot 法檢測 PC-9 細(xì)胞和 PC-9/GR 細(xì)胞中 P-STAT3 和 survivin 蛋白的表達(dá),免疫熒光檢測Oct4和p-STAT3蛋白在PC-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞的表達(dá)。應(yīng)用Oct4-siRNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建特異性沉默Oct4基因表達(dá)的PC-9和PC-9/GR細(xì)胞系,分為四組:Con-siRNA PC-9細(xì)胞組(轉(zhuǎn)染Con-siRNA)、Oct4-siRNA PC-9 細(xì)胞組(轉(zhuǎn)染 Oct4-siRNA)、Con-siRNA PC-9/GR 細(xì)胞組(轉(zhuǎn)染 Con-siRNA)和 Oct4-siRNAPC-9/GR 細(xì)胞組(轉(zhuǎn)染 Oct4-siRNA),采用熒光定量PCR法及western blot法分別檢測上述四組Oct4,p-STAT3和survivin mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果(1)Oct4在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及意義熒光定量PCR檢測結(jié)果表明,NSCLC組中Oct4 mRNA的表達(dá)量明顯高于對照組(t= 3.566,P= 0.008)。Western blot法檢測結(jié)果表明,NSCLC組中Oct4蛋白的表達(dá)量明顯高于對照組(t=3.764,P = 0.007)。免疫組化檢測結(jié)果表明,Oct4蛋白染色陽性呈棕黃色顆粒狀;與對照組相比,NSCLC組Oct4蛋白的陽性細(xì)胞百分比明顯增高(t= 8.033,P0.001)。Oct4的表達(dá)在患者的性別、年齡、吸煙指數(shù)和腫塊大小等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而與患者的病理類型,分化程度和TNM分期有關(guān),在腺癌、分化程度低和TNM Ⅲ期的患者中Oct4表達(dá)明顯增加(P0.05)。(2)Oct4在非小細(xì)胞肺癌增殖及對吉非替尼耐藥中的作用與 PC-9 細(xì)胞相比,PC-9/GR 細(xì)胞中 Oct4 mRNA(t = 4.21,P = 0.006)和Oct4蛋白(t = 4.233,P = 0.005)的表達(dá)量均明顯增高。在PC-9細(xì)胞中,Oct4-siRNA組Oct4蛋白的表達(dá)量明顯低于Con-siRNA組(t = 3.985,P =0.009)。在PC-9/GR細(xì)胞中,Oct4-siRNA組Oct4蛋白的表達(dá)量明顯低于Con-siRNA 組(t = 4.117,P = 0.007)。在 PC-9 和 PC-9/GR 細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h時(shí)Oct4-siRNA組增殖活性均明顯低于Con-siRNA組(P0.05)。在PC-9細(xì)胞中,與Con-siRNA組相比,Con-siRNA + Gefitnib組的細(xì)胞凋亡率明顯增高(X 2= 8.644,P = 0.003);與 Oct4-siRNA 組相比,Oct4-siRNA +Gefitnib組的細(xì)胞凋亡率明顯增高(X2=9.019,P= 0.002)。在PC-9/GR細(xì)胞中,與Con-siRNA組相比,Con-siRNA + Gefitnib組的細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X2 =1.413,P= 0.872);與 Oct4-siRNA組相比,Oct4-siRNA+Gefitnib組的細(xì)胞凋亡率明顯增高(X2= 8.798,P=0.004)。(3)OCT4對非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的機(jī)制研究與PC-9細(xì)胞相比,PC-9/GR細(xì)胞中磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的表達(dá)量明顯增高(t = 4.197,P=0.004);與PC-9細(xì)胞相比,PC-9/GR細(xì)胞中survivin蛋白的表達(dá)量明顯增高(t= 3.639,P= 0.008)。免疫熒光檢測結(jié)果表明,Oct4與p-STAT3蛋白在PC-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞均表達(dá)于細(xì)胞核,而兩者在PC-9/GR細(xì)胞中的表達(dá)水平較PC-9細(xì)胞明顯提高。熒光定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),在 PC-9 細(xì)胞,Oct4-siRNA 組 Oct4、p-STAT3 和 survivin mRNA 的表達(dá)量與 Con-siRNA 組相比均明顯減少(t= 2.934,3.024,3.216,P=0.037,0.031,0.025);在 PC-9/GR 細(xì)胞,Oct4-siRNA 組 Oct4、p-STAT3 和 survivin mRNA的表達(dá)量與Con-siRNA組相比均明顯減少(t= 3.108,2.014,2.572,P =0.009,0.028,0.017)。Western blot 法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),在 PC-9 細(xì)胞,Oct4-siRNA 組 Oct4、p-STAT3 和 survivin 蛋白的表達(dá)量與 Con-siRNA 組相比均明顯減少(t =2.889,2.985,2.917,P= 0.018,0.007,0.013);在 PC-9/GR細(xì)胞,Oct4-siRNA 組 Oct4、p-STAT3 和 survivin 蛋白的表達(dá)量與 Con-siRNA組相比均明顯減少(= 3.737,3.756,3.011,P= 0.002,0.002,0.007)。結(jié)論(1)Oct4在NSCLC組織中的表達(dá)增加;Oct4高表達(dá)與NSCLC的低分化、TNM分期高及病理分型有關(guān),Oct4高表達(dá)可作為NSCLC預(yù)后差的一個(gè)判斷指標(biāo)。(2)Oct4與NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性有關(guān)。特異性沉默Oct4基因表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的的耐藥性并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。(3)p-STAT3/survivin信號(hào)通路可能與NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的的獲得性耐藥有關(guān)。Oct4的下調(diào)可以逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的的獲得性耐藥,其機(jī)制可能與p-STAT3/survivin信號(hào)通路有關(guān)。創(chuàng)新性及意義本研究發(fā)現(xiàn)Oct4在維持肺腺癌細(xì)胞PC-9/GR對吉非替尼的耐藥性方面具有重要作用,選擇性抑制Oct4表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)PC-9/GR對吉非替尼的耐藥性,并首次提出Oct4在肺癌細(xì)胞對吉非替尼耐藥性的調(diào)節(jié)機(jī)制可能是通過STAT3/survivin信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。通過對NSCLC吉非替尼耐藥機(jī)制的進(jìn)一步了解,可以為臨床上開辟新的NSCLC靶向治療手段奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1657666