本文選題：組織蛋白酶D　切入點(diǎn)：細(xì)胞老化　出處：《中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所》2016年博士論文

【摘要】：組織蛋白酶D(Cath D)是在細(xì)胞中廣泛分布的一種溶酶體內(nèi)的蛋白水解酶,該蛋白對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)起到了重要作用。一方面,Cath D可以通過水解其他蛋白,如蛋白酶原、纖維連接蛋白等,發(fā)揮其生物學(xué)功能。另一方面,被釋放到胞漿中的Cath D會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的水解,從而引發(fā)凋亡。近些年來,該蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到的作用引起了人們的日益關(guān)注。與癌旁／正常組織相比,該蛋白經(jīng)常在腫瘤組織中過表達(dá),而且Cath D的過表達(dá)可以顯著增強(qiáng)癌癥細(xì)胞的侵襲性。盡管關(guān)于Cath D與腫瘤發(fā)生的報(bào)道很多,但這樣的報(bào)道絕大多數(shù)都是關(guān)聯(lián)性的,其背后的分子機(jī)制尚不完全清楚。我們認(rèn)為其分子機(jī)制的缺失主要是由兩方面引起的,一是大多數(shù)Cath D在腫瘤細(xì)胞中的功能研究都利用了其過表達(dá)的模型。由于Cath D在腫瘤細(xì)胞中本底表達(dá)量已經(jīng)較相對(duì)正常細(xì)胞有所提高,利用這樣的研究模型觀察到的細(xì)胞表型以及信號(hào)通路的改變可能并不大。二是直到目前為止,針對(duì)Cath D引起的全局性蛋白質(zhì)改變的研究仍然很缺乏,大多數(shù)的研究?jī)H僅局限于少數(shù)幾條特異的蛋白或信號(hào)通路上。因此對(duì)Cath D基因沉默引發(fā)的全面蛋白質(zhì)組變化進(jìn)行表征會(huì)加深對(duì)Cath D在癌癥細(xì)胞中功能的理解。本實(shí)驗(yàn)室前期在HeLa細(xì)胞中利用基因沉默的手段建立了Cath D穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞株,HeLa-CR,并對(duì)該細(xì)胞株表型進(jìn)行了初步的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞老化水平顯著提高,并伴隨著細(xì)胞周期在G2-M期的阻滯。為了對(duì)Cath D引起的蛋白質(zhì)組變化進(jìn)行多維度的觀察,對(duì)HeLa-CR細(xì)胞的胞漿、溶酶體和細(xì)胞核三個(gè)亞細(xì)胞組分進(jìn)行了基于氨基酸體內(nèi)標(biāo)記法(SILAC,Stable Isotope Labeling with Amino Acid)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)Cath D的基因沉默造成二十余個(gè)注釋為溶酶體定位的蛋白質(zhì)在溶酶體組分中豐度下降,而相應(yīng)的在胞漿中的豐度上升,提示HeLa-CR的溶酶體狀態(tài)可能受到了影響。另一方面,氧化還原蛋白的豐度在HeLa-CR的胞漿中顯著下調(diào),提示細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)受到了干擾�；谏鲜鰜喖�(xì)胞組分的定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果以及細(xì)胞溶酶體狀態(tài)以及氧化還原穩(wěn)態(tài)與細(xì)胞老化之間的關(guān)聯(lián)性,Cath D基因沉默有可能會(huì)升高溶酶體膜通透性以及ROS水平,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞老化。進(jìn)一步的驗(yàn)證分析證實(shí)了這一點(diǎn),并且發(fā)現(xiàn)ROS在Cath D基因沉默誘導(dǎo)細(xì)胞老化的過程中起到重要作用。另外在HeLa-CR細(xì)胞中,盡管ROS水平升高,但抗氧化轉(zhuǎn)錄因子NRF2活性是相對(duì)降低的,并且利用實(shí)驗(yàn)揭示這一現(xiàn)象的產(chǎn)生的原因：長(zhǎng)期氧化壓力可以抑制NRF2的轉(zhuǎn)錄活性以及抗氧化蛋白的豐度。結(jié)合前人關(guān)于Cath D在腫瘤組織中高表達(dá)的發(fā)現(xiàn),我們的研究結(jié)果提示了Cath D在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到了維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),防止細(xì)胞老化的作用。
[Abstract]:Cathepsin D(Cath D, a proteolytic enzyme widely distributed in cells, plays an important role in maintaining intracellular homeostasis. On the one hand, cathepsin D can hydrolyze other proteins, such as proproteinogen. On the other hand, Cath D released into the cytoplasm can induce the hydrolysis of apoptosis-related proteins, thus inducing apoptosis. The role of the protein in tumorigenesis and development has attracted increasing attention. Compared with paracancerous / normal tissues, the protein is often overexpressed in tumor tissues. And overexpression of Cath D can significantly increase the invasiveness of cancer cells. Although there have been a lot of reports about Cath D and tumorigenesis, most of these reports are related. The molecular mechanism behind it is not completely clear. We believe that the absence of the molecular mechanism is mainly caused by two aspects. One is that most of the studies on the function of Cath D in tumor cells have made use of its overexpression model, because the background expression of Cath D in tumor cells has been increased compared with that of normal cells. The changes in cell phenotypes and signaling pathways observed using this model may not be significant. Second, until now, studies of global protein changes caused by Cath D have been scarce. Most studies are limited to a few specific protein or signaling pathways. Therefore, characterization of the total proteome changes caused by Cath D gene silencing will enhance the understanding of the function of Cath D in cancer cells. A stable and low expression Cath D cell line, HeLa-CR-R, was established by gene silencing in HeLa cells in the early stage of the experiment, and the phenotype of the cell line was preliminarily determined. In order to observe the proteome changes induced by Cath D, the cytoplasm of HeLa-CR cells was observed. Three subcellular components of lysosome and nucleus were analyzed by quantitative proteomic analysis based on amino acid labeling method: silac Isotope Labeling with Amino acid.The gene silencing of Cath D resulted in more than 20 proteins annotated as lysosomal localization. The abundance of lysosome components decreased, The corresponding increase in cytoplasmic abundance suggests that the lysosomal state of HeLa-CR may be affected. On the other hand, the redox protein abundance is significantly down-regulated in the cytoplasm of HeLa-CR. Based on the quantitative proteomics results of the above subcellular components and the relationship between redox homeostasis and cellular aging, the relationship between redox homeostasis and cell aging is also discussed, based on the quantitative proteomics results of the above subcellular components and the correlation between redox homeostasis and cell aging. It is possible to increase the permeability of lysosomal membrane and the level of ROS. Further validation analysis confirmed this and found that ROS plays an important role in the process of cell aging induced by Cath D gene silencing. In addition, in HeLa-CR cells, despite the increase of ROS level, However, the activity of antioxidant transcription factor NRF2 was relatively decreased. The reasons for this phenomenon were revealed by experiments: long term oxidative pressure could inhibit the transcription activity of NRF2 and the abundance of antioxidant protein, combined with previous findings on the high expression of Cath D in tumor tissues. Our results suggest that Cath D plays an important role in maintaining homeostasis and preventing cell aging during tumorigenesis and development.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2

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