本文選題：Hep-2細(xì)胞　切入點(diǎn)：RNA干擾　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤,在我國(guó)占頭頸部腫瘤的13.9%。喉癌的治療目前多采用以手術(shù)為主、聯(lián)合放化療的綜合治療,在最大程度根除腫瘤的基礎(chǔ)上保全喉的功能,在保證患者的生存率的同時(shí)提高生存質(zhì)量。但手術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是喉癌的主要致死原因,而且放療和化療毒副作用較大。因此,尋找新的安全、有效、毒副作用小的治療方法成了關(guān)注的焦點(diǎn)。細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡失常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中普遍存在的現(xiàn)象已經(jīng)得到研究人員的共識(shí)。Bcl-2基因是一原癌基因,其高表達(dá)可引起腫瘤發(fā)生,而且它能夠明顯延長(zhǎng)細(xì)胞的生存,是目前公認(rèn)的比較重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因。Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的IAP家族成員,在人類常見的腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。Bcl-2和survivin基因在喉癌組織中均呈現(xiàn)高度表達(dá),而且其表達(dá)與組織病理的分化程度降低、臨床分期的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)呈正相關(guān)。由于腫瘤是一種多基因參加,多步驟與多階段的疾病,因此針對(duì)上述兩個(gè)基因靶點(diǎn)的聯(lián)合治療可能會(huì)起到更好地效果。近年來RNA干擾技術(shù)被應(yīng)用于惡性腫瘤基因治療的試驗(yàn)研究中。它通過小干擾RNA與目的癌基因的mRNA按照堿基互補(bǔ)的原理特異性結(jié)合,干擾目的基因的翻譯、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)形成的功能,阻止目的蛋白生成,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或向成熟方向分化,進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。紫杉醇是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的、具有廣譜高效抗癌活性的藥物。已有多個(gè)臨床研究證實(shí)紫杉醇在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌治療中具有較好的效果。因此本研究把bcl-2、survivin基因和紫杉醇作為生物化療聯(lián)合應(yīng)用研究的靶點(diǎn),利用RNAi技術(shù)研究將兩種基因同時(shí)沉默并聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)觀察其對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞的影響,探究其相互作用的機(jī)制,為腫瘤治療尋找新的安全有效的途徑。研究目的：(1)構(gòu)建bcl-2 shRNA及survivin shRNA慢病毒表達(dá)載體,探討利用RNAi技術(shù)沉默喉癌Hep-2細(xì)胞中bcl-2和survivin基因后,細(xì)胞中相應(yīng)目的基因的表達(dá)情況。(2)觀察bcl-2和survivin基因沉默后對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及細(xì)胞周期的影響。(3)探討共轉(zhuǎn)染bcl-2 shRNA及survivin shRNA后Hep-2細(xì)胞中相應(yīng)目的基因的表達(dá)情況及對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響。(4)闡明共轉(zhuǎn)染bcl-2、survivin基因shRNA對(duì)Taxol誘導(dǎo)的Hep-2細(xì)胞凋亡的影響。研究方法：(1)根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則構(gòu)建bcl-2 shRNA及survivin shRNA慢病毒表達(dá)載體。(2)采用RT-PCR方法檢測(cè)shRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞中bcl-2和survivin基因mRNA水平的影響。(3)用Western blot方法檢測(cè)shRNA轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)染聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)后對(duì)Hep-2細(xì)胞中bcl-2和survivin蛋白水平的影響。(4)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)shRNA轉(zhuǎn)染及紫杉醇誘導(dǎo)后Hep-2細(xì)胞的形態(tài)變化及目的基因的表達(dá)情況。(5)用CCK-8法檢測(cè)bcl-2 shRNA及survivin shRNA單獨(dú)轉(zhuǎn)染、共轉(zhuǎn)染及其聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)后對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響。(6)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染bcl-2 shRNA、survivin shRNA及shRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)后對(duì)Hep-2細(xì)胞周期的影響。(7)用caspase3舌性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)共轉(zhuǎn)染bcl-2 shRNA、survivin shRNA對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)的Hep-2中caspase3的活性。(8)應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,對(duì)計(jì)量資料,多個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析及重復(fù)測(cè)量資料的方差分析,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)P0.05。結(jié)果(1)利用RNAi技術(shù)成功的構(gòu)建了Survivin和Bcl-2基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體,并成功轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后目的基因的siRNA在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。(2)Bcl-2和survivin siRNA干擾喉癌Hep-2細(xì)胞后,單獨(dú)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中相應(yīng)沉默的基因的mRNA表達(dá)減少(P0.01),共轉(zhuǎn)染組較單獨(dú)轉(zhuǎn)染組減少顯著(P0.01)。(3)Western blot顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達(dá)減少(P0.01),共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中較單獨(dú)轉(zhuǎn)染組顯著減少(P0.01)。加入紫杉醇后各組細(xì)胞中目的蛋白均比未加紫杉醇組細(xì)胞中表達(dá)明顯減少(P0.05),且轉(zhuǎn)染聯(lián)合組中目的蛋白的表達(dá)較加入紫杉醇前明顯減少(P0.01)。(4)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示在激光掃描共聚焦顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染組中相應(yīng)基因的表達(dá)減弱,且轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變。紫杉醇作用后細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的凋亡小體,且凋亡細(xì)胞內(nèi)目的基因表達(dá)減少。(5)Bcl-2和survivin siRNA分別干擾喉癌Hep-2細(xì)胞后,可以明顯抑制其增殖(P0.05),共轉(zhuǎn)染組較單獨(dú)轉(zhuǎn)染組抑制作用更明顯(P0.05),而且發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染48h時(shí)各轉(zhuǎn)染組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用穩(wěn)定且高效。(6)Bcl-2和survivin siRNA干擾喉癌Hep-2細(xì)胞,可以影響其細(xì)胞周期。沉默bcl-2基因后出現(xiàn)S期阻滯；沉默survivin后導(dǎo)致由G1期進(jìn)入S期細(xì)胞減少,出現(xiàn)了G0/G1期阻滯,從而抑制了細(xì)胞增殖。(7)紫杉醇誘導(dǎo)喉Hep-2細(xì)胞24h和48h細(xì)胞生長(zhǎng)均被顯著抑制(P0.05和P0.01),但兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制無明顯差別(P0.05)(8)通過轉(zhuǎn)染聯(lián)合紫杉醇作用的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上來檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24h時(shí)加入紫杉醇聯(lián)合誘導(dǎo)24h,此時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果最顯著(P0.05),優(yōu)于單獨(dú)轉(zhuǎn)染組及紫杉醇作用組(P0.05)。(9)Bcl-2和survivin siRNA干擾喉癌Hep-2細(xì)胞后,caspase3活性顯著增強(qiáng)(P0.01),且共轉(zhuǎn)染組較單獨(dú)轉(zhuǎn)染組明顯(P0.05)。聯(lián)合紫杉醇作用后其活性較單獨(dú)作用時(shí)明顯(P0.05),尤其是轉(zhuǎn)染survivin siRNA聯(lián)合紫杉醇組更明顯(P0.01)。(10)紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)了G2/M期阻滯。轉(zhuǎn)染pshRNA-Survivin聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)后,G2/M期細(xì)胞阻滯較單獨(dú)紫杉醇作用更明顯。Survivin基因沉默后增強(qiáng)了紫杉醇對(duì)細(xì)胞周期G2/M期的阻滯作用。結(jié)論(1)利用RNAi技術(shù)成功的構(gòu)建了Survivin和Bcl-2基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體,并成功轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后目的基因siRNA在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。(2)Survivin和Bcl-2 shRNA可有效沉默喉癌Hep-2細(xì)胞中的Survivin和Bcl-2基因,下調(diào)其蛋白及mRNA的表達(dá)水平,且二者共轉(zhuǎn)染后兩種基因的表達(dá)的均減少,且較單獨(dú)沉默時(shí)更明顯。并且兩種基因沉默后明顯地抑制了Hep-2細(xì)胞的增殖,增強(qiáng)了caspase3的活性,且同時(shí)沉默時(shí)作用更顯著,這兩種基因可協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。(3)紫杉醇誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞后可明顯抑制細(xì)胞增殖,有效增強(qiáng)caspase3的活性,而且細(xì)胞中bcl-2和survivin蛋白表達(dá)明顯減少,紫杉醇抑制了兩種抗凋亡基因的表達(dá)。(4)共轉(zhuǎn)染Survivin和Bcl-2 shRNA與紫杉醇聯(lián)合誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞,共沉默的基因可明顯提高紫杉醇抗腫瘤細(xì)胞增殖的效果,并可協(xié)同其細(xì)胞周期阻滯及促進(jìn)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)抗腫瘤作用的療效。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王歡;馬志強(qiáng);楊峰;;用于腫瘤治療的小分子干擾RNA非病毒載體研究進(jìn)展[J];藥學(xué)實(shí)踐雜志;2015年06期

2 李雷激;劉躍華;高琳;趙沖;;凋亡基因Survivin,P53,Bcl-2和Bax在喉癌組織中的表達(dá)及與放療的敏感性[J];瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2015年04期

3 吳春芳;李玲香;李海洲;李富;米玉錄;;Survivin、Fhit蛋白在喉癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J];解放軍醫(yī)藥雜志;2015年01期

4 吳春芳;李海洲;李富;;喉癌組織中Survivin、MMP-2的表達(dá)、臨床意義及相關(guān)性研究[J];中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥;2015年01期

5 張麗;胡汪來;王家鈺;張旭東;張林杰;;Bcl-2在紫杉醇耐藥胃腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年08期

6 齊志勇;賈永峰;張治平;朱林琳;;S100A4、Bcl-2、Survivin在喉癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2014年09期

7 劉宏俠;孫玉滿;曹渤海;梁振;;喉癌切緣組織中PTEN和Survivin表達(dá)與局部復(fù)發(fā)的關(guān)系[J];臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志;2013年12期

8 李澤文;周潔;何源萍;嚴(yán)福波;楊志敏;丁珠華;;喉癌組織中Survivin表達(dá)及其臨床意義的Meta分析[J];中國(guó)循證醫(yī)學(xué)雜志;2013年10期

9 張?jiān)娒?劉非;鄭磊;王前;;以適體作為載體介導(dǎo)siRNA靶向運(yùn)輸?shù)难芯窟M(jìn)展[J];分子診斷與治療雜志;2013年04期

10 李文雁;劉巍;孟曉潔;;siRNA共轉(zhuǎn)染沉默bcl-2和XIAP基因?qū)MSCC12細(xì)胞放射增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志;2012年01期

，

本文編號(hào)：1651246