發(fā)布時間：2018-03-22 22:03

  本文選題：LncRNA　切入點：肝細胞癌　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學院》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)生和發(fā)展是一個多因素參與的復雜調控過程；長鏈非編碼RNAs (Long non-coding RNA, LncRNAs)是指不具備蛋白編碼能力的,長度大于200個核苷酸的RNA轉錄本。LncRNA參與調節(jié)細胞增殖、凋亡、遷移、基因組穩(wěn)定性等多種生理過程,其異常表達與多種疾病密切相關,包括腫瘤。因此,尋找到肝癌中異常表達的LncRNA,揭示其在肝癌中的生物學功能及調節(jié)的信號通路,對闡明肝癌的發(fā)生發(fā)展機制、發(fā)現(xiàn)潛在的診斷和治療靶點具有重要意義。方法：采用晶芯(?)lncRNA芯片檢測16對肝癌及癌旁組織中LncRNA的表達,篩選表達差異的LncRNA 。通過實時定量PCR技術檢測LncTSG1在肝癌組織與癌旁組織中的表達水平,進一步驗證芯片結果。通過RACE技術鑒定LncTSG1的5’和3’序列,進行數(shù)據(jù)庫比對并擴增LncTSG1全長。通過在肝癌細胞中上調/下調LncTSG1的表達水平,檢測對肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響。通過生物信息學分析技術及RNA Pull Down聯(lián)合質譜分析、RIP等實驗方法尋找LncTSG1相互作用蛋白及調節(jié)的信號網(wǎng)絡。結果：采用晶芯(?)lncRNA芯片對16對肝癌及對應癌旁組織中的LncRNA表達進行檢測,分析發(fā)現(xiàn)和癌旁組織相比,LncTSG1在肝癌組織中表達顯著下降。通過實時定量PCR技術對43對肝癌組織及相應癌旁組織中LncTSG1的表達水平進行檢測,發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組織LncTSG1在肝癌組織中的表達水平顯著下調,與芯片結果一致。通過RACE技術鑒定出LncTSG1的5’端和3’端序列,并成功擴增出LncTSG1的全長,與數(shù)據(jù)庫中的序列比對,結果顯示5’端序列與數(shù)據(jù)庫中注釋的序列一致,3’端序列較數(shù)據(jù)庫中注釋的序列少約100bp。對表達譜芯片結果進行生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)LncTSG1與參與EMT及細胞遷移相關的信號通路關系密切。通過在肝癌細胞中上調/下調LncTSG1的表達,進行相應的細胞功能學實驗,結果顯示,通過轉染LncTSG1的重組質粒上調LncTSGl表達后,肝癌細胞的遷移和侵襲能力降低;通過siRNA干擾下調LncTSG1的表達后,肝癌細胞的遷移和侵襲能力增強,而增殖能力無明顯變化。同時,下調LncTSG1可促進肝癌細胞發(fā)生EMT轉變。熒光原位雜交及細胞組分分離技術證實LncTSG1主要定位于細胞漿。采用生物信息學方法分析并通過RIP實驗發(fā)現(xiàn)LncTSG1可與AG02結合,提示LncTSG1在胞漿中可作為ceRNA發(fā)揮作用。通過預測軟件分析可能與LncTSG1結合的micoRNA,并通過文獻檢索,發(fā)現(xiàn)has-miR-372和has-miR-10b與腫瘤的轉移相關,是LncTSG1潛在調控靶點。通過實時定量PCR檢測二者下游靶基因的表達水平,發(fā)現(xiàn)抑制LncTSG1的表達能夠顯著下調腫瘤轉移相關基因ARHGAP6、CELF2、MAPK10、TNS1、SYNPO2的表達,表明LncTSG1可能通過干擾has-miR-372和has-miR-10b對下游mRNA的調控來發(fā)揮ceRNA的功能。同時,通過RNA Pull Down聯(lián)合質譜分析發(fā)現(xiàn)LncTSG1可與腫瘤轉移相關蛋白hnRNP H結合。結論：與正常肝組織相比LncTSG1在肝癌組織標本中表達量顯著下調。LncTSG1能夠顯著抑制肝癌細胞的遷移、侵襲能力及EMT轉變,表明LncTSG1是肝癌中重要的抑癌基因,是潛在的治療靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1650579