本文選題：乳腺癌　切入點：uMUC1　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位,因此乳腺癌的早期診斷、早期治療對乳腺癌患者至關(guān)重要。分子影像學(xué)運用影像學(xué)手段檢測組織中疾病相關(guān)分子的變化,從分子水平對組織細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分,因此對疾病的早期檢出、早期治療及診療一體化有重要價值。黏蛋白MUC1 (mucin1)在上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá),而在乳腺癌中其糖基化水平明顯降低、表達(dá)量明顯升高,且在細(xì)胞表面分布失去極性。因此,靶向去糖基化MUC1 (uMUC1)可能對于乳腺癌早期識別、乳腺癌的預(yù)后評估及治療方式選擇有幫助。目前,靶向uMUC1熒光探針用于臨床早期乳腺癌影像診斷尚缺乏深入研究。為了研究靶向uMUC1熒光探針對乳腺癌細(xì)胞的顯像效果,我們選取了抗uMUC1抗體(VU4H5)用于構(gòu)建靶向探針。為了確定該抗體對uMUC1陽性乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞的結(jié)合效果,我們用抗體孵育MCF7細(xì)胞后進(jìn)行了流式細(xì)胞分析。結(jié)果表明與抗uMUC1抗體孵育的MCF7細(xì)胞其熒光強度明顯超過與對照Normal IgG孵育的MCF7細(xì)胞,說明抗uMUC1抗體可以結(jié)合MCF7細(xì)胞。同樣地,我們用抗uMUC1抗體孵育另一uMUC1陽性細(xì)胞系MDA-MB-468細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示抗uMUC1抗體也可以與MDA-MB-468細(xì)胞結(jié)合。以上結(jié)果表明,抗uMUC1抗體能夠結(jié)合已知uMUC1陽性乳腺癌細(xì)胞系。在小鼠體內(nèi)評估靶向熒光探針的靈敏度和特異度的工具細(xì)胞應(yīng)具有可檢測和可追蹤的特性。而綠色熒光蛋白(GFP)作為常用的熒光標(biāo)簽蛋白可被影像設(shè)備所檢測。因此,為了獲得可追蹤檢測的MCF7細(xì)胞,我們在MCF7細(xì)胞中整合表達(dá)GFP。首先,我們用hU6-MCS-Ubiquitin-eGFP-IRES-puromycin慢病毒感染MCF7細(xì)胞。實驗結(jié)果顯示,病毒的感染復(fù)數(shù)(multiple of infection, MOI)為50及同時使用5μg/mL聚凝胺(polybrene)時感染效率最高。隨后,我們使用3μg/mL的嘌呤霉素(puromycin)對慢病毒整合MCF7細(xì)胞進(jìn)行篩選。經(jīng)過2周持續(xù)的篩選及連續(xù)傳代后,我們獲得了穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞株MCF7-GFP。通過細(xì)胞生長曲線、劃痕實驗及碘化丙啶(PI)單染法流式細(xì)胞周期檢測實驗,我們發(fā)現(xiàn)MCF7-GFP細(xì)胞與MCF7對照細(xì)胞的增殖狀態(tài)及細(xì)胞周期沒有顯著差別。此外,我們利用生物光學(xué)成像系統(tǒng)(Xenogen, IVIS 300)對MCF7-GFP細(xì)胞進(jìn)行了熒光成像,確認(rèn)了MCF7-GFP細(xì)胞可被熒光成像系統(tǒng)檢測。以上結(jié)果表明,我們構(gòu)建的MCF7-GFP細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)GFP且增殖速率與MCF7細(xì)胞無明顯差異。慢病毒可將外源基因隨機整合入宿主基因組并進(jìn)行復(fù)制,進(jìn)而可能對宿主自身的基因表達(dá)造成干擾,因此我們檢測了MCF7-GFP細(xì)胞的uMUC1表達(dá)情況。免疫印跡法及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均顯示,MCF7-GFP細(xì)胞較野生型MCF7細(xì)胞的uMUC1表達(dá)量下降,但流式細(xì)胞分析結(jié)果提示抗uMUC1抗體仍可以特異性地結(jié)合MCF7-GFP細(xì)胞。以上結(jié)果表明,雖然MCF7-GFP細(xì)胞uMUC1表達(dá)量較MCF7細(xì)胞有所降低,但仍適用于靶向uMUC1探針成像的研究。接下來,我們使用具有活性基團N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS Ester)的IRDye800染料與抗uMUC1抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到抗uMUC1-IRDye800探針,并使用活體成像系統(tǒng)評價其對MCF7-GFP細(xì)胞的結(jié)合效率。我們發(fā)現(xiàn)10μg/mL的探針在37℃與細(xì)胞孵育30min后與細(xì)胞結(jié)合。而隨著孵育時間的延長,其結(jié)合率沒有顯著增高。同時,我們使用IRDye800羧化物(Carboxylate)作為陰性對照探針研究抗uMUC1-IRDye800探針與細(xì)胞結(jié)合的特異性。我們發(fā)現(xiàn),在探針濃度為10μg/mL時與抗uMUC1-IRDye800探針孵育的細(xì)胞的熒光強度明顯高于與陰性對照探針孵育的細(xì)胞；且隨著探針濃度的增加,熒光強度逐漸增加。然而,與陰性對照探針孵育的細(xì)胞的熒光強度隨著探針濃度的增加沒有顯著改變。隨后,我們通過MTT法檢測探針對細(xì)胞的毒性作用發(fā)現(xiàn),抗uMUC1-IRDye800探針僅在高濃度(50μg/mL)時對MCF7-GFP細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。以上結(jié)果表明,抗uMUC1-IRDye800探針能有效靶向MCF7-GFP細(xì)胞且在有效濃度下無明顯細(xì)胞毒性。綜上所述,本研究構(gòu)建了一株穩(wěn)定表達(dá)GFP的人乳腺癌MCF7細(xì)胞株,并初步利用抗uMUC1抗體(VU4H5)與IRDye800結(jié)合探針成功地在體外對MCF7-GFP細(xì)胞進(jìn)行了熒光成像。該研究為將來在動物體內(nèi)開展乳腺癌影像研究提供了一株工具細(xì)胞株,也為靶向uMUC1熒光探針用于乳腺癌顯像提供了初步的實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：1648706