本文選題：乳腺癌　切入點：uMUC1　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位,因此乳腺癌的早期診斷、早期治療對乳腺癌患者至關重要。分子影像學運用影像學手段檢測組織中疾病相關分子的變化,從分子水平對組織細胞進行區(qū)分,因此對疾病的早期檢出、早期治療及診療一體化有重要價值。黏蛋白MUC1 (mucin1)在上皮細胞中廣泛表達,而在乳腺癌中其糖基化水平明顯降低、表達量明顯升高,且在細胞表面分布失去極性。因此,靶向去糖基化MUC1 (uMUC1)可能對于乳腺癌早期識別、乳腺癌的預后評估及治療方式選擇有幫助。目前,靶向uMUC1熒光探針用于臨床早期乳腺癌影像診斷尚缺乏深入研究。為了研究靶向uMUC1熒光探針對乳腺癌細胞的顯像效果,我們選取了抗uMUC1抗體(VU4H5)用于構(gòu)建靶向探針。為了確定該抗體對uMUC1陽性乳腺癌細胞系MCF7細胞的結(jié)合效果,我們用抗體孵育MCF7細胞后進行了流式細胞分析。結(jié)果表明與抗uMUC1抗體孵育的MCF7細胞其熒光強度明顯超過與對照Normal IgG孵育的MCF7細胞,說明抗uMUC1抗體可以結(jié)合MCF7細胞。同樣地,我們用抗uMUC1抗體孵育另一uMUC1陽性細胞系MDA-MB-468細胞,流式細胞術結(jié)果提示抗uMUC1抗體也可以與MDA-MB-468細胞結(jié)合。以上結(jié)果表明,抗uMUC1抗體能夠結(jié)合已知uMUC1陽性乳腺癌細胞系。在小鼠體內(nèi)評估靶向熒光探針的靈敏度和特異度的工具細胞應具有可檢測和可追蹤的特性。而綠色熒光蛋白(GFP)作為常用的熒光標簽蛋白可被影像設備所檢測。因此,為了獲得可追蹤檢測的MCF7細胞,我們在MCF7細胞中整合表達GFP。首先,我們用hU6-MCS-Ubiquitin-eGFP-IRES-puromycin慢病毒感染MCF7細胞。實驗結(jié)果顯示,病毒的感染復數(shù)(multiple of infection, MOI)為50及同時使用5μg/mL聚凝胺(polybrene)時感染效率最高。隨后,我們使用3μg/mL的嘌呤霉素(puromycin)對慢病毒整合MCF7細胞進行篩選。經(jīng)過2周持續(xù)的篩選及連續(xù)傳代后,我們獲得了穩(wěn)定表達GFP的細胞株MCF7-GFP。通過細胞生長曲線、劃痕實驗及碘化丙啶(PI)單染法流式細胞周期檢測實驗,我們發(fā)現(xiàn)MCF7-GFP細胞與MCF7對照細胞的增殖狀態(tài)及細胞周期沒有顯著差別。此外,我們利用生物光學成像系統(tǒng)(Xenogen, IVIS 300)對MCF7-GFP細胞進行了熒光成像,確認了MCF7-GFP細胞可被熒光成像系統(tǒng)檢測。以上結(jié)果表明,我們構(gòu)建的MCF7-GFP細胞株穩(wěn)定表達GFP且增殖速率與MCF7細胞無明顯差異。慢病毒可將外源基因隨機整合入宿主基因組并進行復制,進而可能對宿主自身的基因表達造成干擾,因此我們檢測了MCF7-GFP細胞的uMUC1表達情況。免疫印跡法及流式細胞術結(jié)果均顯示,MCF7-GFP細胞較野生型MCF7細胞的uMUC1表達量下降,但流式細胞分析結(jié)果提示抗uMUC1抗體仍可以特異性地結(jié)合MCF7-GFP細胞。以上結(jié)果表明,雖然MCF7-GFP細胞uMUC1表達量較MCF7細胞有所降低,但仍適用于靶向uMUC1探針成像的研究。接下來,我們使用具有活性基團N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS Ester)的IRDye800染料與抗uMUC1抗體進行偶聯(lián)得到抗uMUC1-IRDye800探針,并使用活體成像系統(tǒng)評價其對MCF7-GFP細胞的結(jié)合效率。我們發(fā)現(xiàn)10μg/mL的探針在37℃與細胞孵育30min后與細胞結(jié)合。而隨著孵育時間的延長,其結(jié)合率沒有顯著增高。同時,我們使用IRDye800羧化物(Carboxylate)作為陰性對照探針研究抗uMUC1-IRDye800探針與細胞結(jié)合的特異性。我們發(fā)現(xiàn),在探針濃度為10μg/mL時與抗uMUC1-IRDye800探針孵育的細胞的熒光強度明顯高于與陰性對照探針孵育的細胞；且隨著探針濃度的增加,熒光強度逐漸增加。然而,與陰性對照探針孵育的細胞的熒光強度隨著探針濃度的增加沒有顯著改變。隨后,我們通過MTT法檢測探針對細胞的毒性作用發(fā)現(xiàn),抗uMUC1-IRDye800探針僅在高濃度(50μg/mL)時對MCF7-GFP細胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。以上結(jié)果表明,抗uMUC1-IRDye800探針能有效靶向MCF7-GFP細胞且在有效濃度下無明顯細胞毒性。綜上所述,本研究構(gòu)建了一株穩(wěn)定表達GFP的人乳腺癌MCF7細胞株,并初步利用抗uMUC1抗體(VU4H5)與IRDye800結(jié)合探針成功地在體外對MCF7-GFP細胞進行了熒光成像。該研究為將來在動物體內(nèi)開展乳腺癌影像研究提供了一株工具細胞株,也為靶向uMUC1熒光探針用于乳腺癌顯像提供了初步的實驗基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：1648706