本文選題：結(jié)直腸癌　切入點：基因突變　出處：《昆明理工大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是人類最為常見的惡性腫瘤之一,隨著我國經(jīng)濟發(fā)展和人民生活水平的提高,生活方式及飲食結(jié)構的改變,CRC發(fā)病人群呈年輕化、發(fā)病率呈逐年上升趨勢,嚴重威脅著我國人民的身心健康。云南高原地區(qū)具有特殊的地理環(huán)境和多變的氣候環(huán)境,聚集多個少數(shù)民族,多元化的地方風俗,多元化的飲食習慣等特點,導致云南地區(qū)人群腸道微環(huán)境的獨特性,可能影響CRC的發(fā)病、瘤內(nèi)異質(zhì)性和基因突變譜。隨著靶向藥物逐漸應用于腫瘤的臨床治療,CRC的靶向治療也向前邁出了重要的一步,靶向治療能明顯延長轉(zhuǎn)移性CRC患者的生存時間,是目前治療轉(zhuǎn)移性CRC最理想的方案。但是,由于腫瘤異質(zhì)性導致靶向基因檢測的困難,從而影響了療效。腫瘤異質(zhì)性是人類惡性腫瘤的重要特征之一,CRC的異質(zhì)性主要是指腫瘤在生長過程中,經(jīng)過多次分裂增殖,其子細胞呈現(xiàn)出分子生物學或基因方面的改變,從而使CRC的生長速度、侵襲能力、乃至藥物的敏感性、預后等各方面產(chǎn)生異質(zhì)性。CRC瘤內(nèi)異質(zhì)性往往會給其治療帶來極大的困難,它與腫瘤微環(huán)境中的酸堿度、氧含量以及葡萄糖含量等有著密切關系。由于瘤內(nèi)異質(zhì)性的存在,可能導致檢測結(jié)果為假陰性,從而影響臨床醫(yī)生對CRC患者病情的評估。因此,正確認識云南地區(qū)環(huán)境因素導致的CRC異質(zhì)性,有助于CRC的診斷及治療方案的選擇�；驕y序是檢測基因突變的重要方法,而傳統(tǒng)的毛細管電泳技術在多個基因進行測序時,不僅費時、費力,而且價格較貴。二代測序技術(Next-generation sequencing,NGS)能同時對腫瘤的多個靶基因進行平行測序,具有通量高、速度快和價格便宜等優(yōu)點,是多基因測序的最佳選擇。本研究基于IlluminaNGS測序平臺,首先對來自3例CRC患者不同空間位置的10個腫瘤樣本及其癌旁正常組織,分析了 329個腫瘤相關基因的突變情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRC患者在原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶的瘤內(nèi)均存在組織分化程度上的異質(zhì)性。2例CRC患者瘤內(nèi)基因突變一致率分別為75%、70.4%。1例CRC伴肝轉(zhuǎn)移患者中,原發(fā)灶、肝轉(zhuǎn)移灶瘤內(nèi)分別有82.8%、90.3%的基因突變相同,原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶之間87.9%的基因突變相同。這些結(jié)果表明基因突變在腫瘤不同空間位置上存在一定的異質(zhì)性,可能與CRC原發(fā)灶在發(fā)展過程中,不同空間位置的微環(huán)境有關,也可能與肝轉(zhuǎn)移灶到了另一個新的微環(huán)境后,發(fā)生了新的基因突變有關。3例CRC患者共檢測到了 59個基因突變,其中有50個基因突變完全不一致,而9個相同的基因突變當中,又有4個基因的突變位點不一致。這一結(jié)果提示CRC患者個體間基因突變的差異較大,可為臨床個體化治療提供了理論依據(jù)。為了進一步了解KRAS基因在云南地區(qū)CRC中的突變率,我們分析了 247例CRC患者KRAS基因第12、13密碼子突變情況,共有59例發(fā)生了突變,突變率為 23.9%,突變類型有 G12D、G12V、G12A、G12C、G12R、G13D,與以前報道過的類型一致,提示KRAS基因在CRC發(fā)病進程中起到了關健作用。KRAS基因的第12、13密碼子突變與性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、分化程度、臨床分期以及TNM分期多項臨床特征之間均沒有顯著性差異,表明KRAS基因突變可能是CRC發(fā)病進程的極早期事件。接著我們分析了 26例CRC患者不同空間位置的144個樣本(包括2例伴有肝轉(zhuǎn)移)的KR4S、BRAF、PIK3C4基因突變和異質(zhì)性情況。發(fā)現(xiàn)7例CRC患者發(fā)生了KRAS基因突變,突變率為26.9%。2例發(fā)生了PIK3CA基因突變,突變率為7.7%。1例患者同時發(fā)生了KRAS、PIK3C4基因突變。所有樣本中沒有發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變。2例肝轉(zhuǎn)移灶瘤內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)這三個基因的突變。7例發(fā)生了KRAS基因突變的CRC患者中,4例患者的5個不同空間位置沒有發(fā)現(xiàn)該基因突變的異質(zhì)性,3例患者存在不同空間位置的異質(zhì)性。2例存在PIK3CA基因突變的患者中,有1例存在該基因突變的異質(zhì)性。這些發(fā)現(xiàn)為臨床精準診療提供了參考依據(jù)。已有研究表明,線粒體作為能量工廠,可能更容易受到腫瘤微環(huán)境的影響,使得腫瘤細胞線粒體DNA(mitochondria DNA,mtDNA)呈現(xiàn)更多異質(zhì)性,可能對CRC的進程和療效產(chǎn)生影響。為進一步認識CRC患者瘤內(nèi)異質(zhì)性,我們對mtDNA D-loop區(qū)的突變和瘤內(nèi)異質(zhì)性進行了研究。我們分析了 22例云南地區(qū)CRC患者不同空間位置的88個樣本,發(fā)現(xiàn)有10例CRC患者mtDNA D-loop區(qū)發(fā)生了突變,突變率為45.5%。突變位點分別為HVSI的16114、16166、16248、16278、16304、16362 及 16390 位點,HVSⅡ 和 Ⅲ 的 71、309 及 573 位點,其中309點位點突變最多,有2例同時在HVSⅠ、HVSⅡ和Ⅲ有突變,其余患者均只發(fā)生了一個位點突變。10例發(fā)生了 mtDNAD-loop區(qū)突變的樣本中,6例突變位于HVSⅠ,6例突變位于HVSⅡ和Ⅲ(2例同時發(fā)生了 HVSⅠ突變),其中有9例存在瘤內(nèi)mtDNAD-loop區(qū)突變的異質(zhì)性,與前面所述的核基因突變相比,腫瘤細胞mtDNA的異質(zhì)性程度明顯偏高。然而,鑒于上述異質(zhì)性位點發(fā)生的復雜性,有關上述異質(zhì)性突變產(chǎn)生的方式,及其是否有功能性改變等均需有待深入研究。綜上所述,云南地區(qū)CRC患者不僅存在個體間基因突變的異質(zhì)性,而且還存瘤內(nèi)異質(zhì)性。CRC患者個體間大部分基因的突變不一致,甚至相同的基因突變還存在突變位點不一致的情況,這一發(fā)現(xiàn)與已有的報道一致。同時,瘤內(nèi)不同空間位置基因突變異質(zhì)性為9.7%-25%,這些數(shù)據(jù)為在云南地區(qū)實施個體化治療提供了理論支持。另外,對KR4S基因的分析表明,云南地區(qū)CRC患者KRAS基因突變率為26.9%,與已有報道的亞洲人突變率一致。11.5%的CRC患者存在瘤內(nèi)KRAS基因突變異質(zhì)性,有研究報道8%的CRC患者存在瘤內(nèi)KRAS基因突變異質(zhì)性,也有研究報道36%的CRC患者存在瘤內(nèi)KRAS基因突變異質(zhì)性。臨床CRC患者KRAS、PIK3C4基因檢測為野生型時,使用抗EGFR靶向藥物療效仍然較差,可能是由于KRAS、PIK3C4基因的瘤內(nèi)異質(zhì)性,導致了單一位點的取樣檢測結(jié)果偏差。我們對腫瘤細胞mtDNA的分析結(jié)果表明,mtDNA突變的瘤內(nèi)異質(zhì)性程度明顯高于核基因突變的異質(zhì)性,可能是由于mtDNA對腫瘤微環(huán)境因素的變化更為敏感,進一步體現(xiàn)了基因與環(huán)境的互作關系。云南地區(qū)CRC腫瘤內(nèi)部基因突變的異質(zhì)性,要求我們在臨床檢測評估CRC患者的基因突變狀態(tài)時,應盡量多的在腫瘤組織的不同空間位置取樣,避免用單一位點的狀態(tài)來解釋整個腫瘤組織的情況,以期為云南地區(qū)CRC患者提供更為精準的診斷、預后和治療策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

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本文編號：1642853