本文選題：前列腺癌　切入點(diǎn)：環(huán)狀RNA　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤,預(yù)后較差,且容易復(fù)發(fā),對(duì)男性健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類新型非編碼RNA,大量存在于真核細(xì)胞中,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,高度保守,具有一定的組織和細(xì)胞特異性。相關(guān)研究表明circRNA與多種疾病有關(guān),特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。但是關(guān)于circRNA在前列腺癌中作用機(jī)制的研究尚無(wú)報(bào)道。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是上皮樣細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變的過(guò)程,它在腫瘤的遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,但是其相關(guān)作用機(jī)制尚未研究清楚。CircRNA在EMT調(diào)控過(guò)程中的作用機(jī)制亦不清楚。本研究旨在闡明circAMOTL1在前列腺癌中的作用及其在EMT調(diào)控過(guò)程中的作用機(jī)制,為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)前列腺癌及前列腺增生組織中circRNA的篩選,發(fā)現(xiàn)circAMOTL1在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào);細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,circAMOTL1可以調(diào)節(jié)EMT標(biāo)志基因的表達(dá)。本研究將對(duì)circAMOTL1在前列腺癌中的表達(dá)及其在EMT調(diào)控過(guò)程中的作用機(jī)制進(jìn)行研究,為circRNA在前列腺癌診治中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。目的:闡明circAMOTL1在前列腺癌中的表達(dá)及其在EMT調(diào)控過(guò)程中的作用機(jī)制。方法:1收取PCa及前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)臨床標(biāo)本,分別提取組織的RNA,及病理切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。2設(shè)計(jì)環(huán)狀RNA連接處的divergent primers和convergent primers并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)circRNAs在前列腺組織及細(xì)胞中的表達(dá),并對(duì)表達(dá)明顯的circRNA進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增并測(cè)序確定序列信息。同時(shí)使用circAMOTL1連接處的熒光探針對(duì)PCa組織及BPH組織進(jìn)行熒光原位雜交,檢測(cè)circAMOTL1的表達(dá)差異。3利用正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞PC3細(xì)胞、lncap細(xì)胞、du145細(xì)胞的rna進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr,用以檢測(cè)circamotl1在前列腺非癌細(xì)胞和癌細(xì)胞中的表達(dá)差異。細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒gfp-circamotl1和gfp-ctl,檢測(cè)兩組circamotl1的表達(dá)。隨后進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn),檢測(cè)gfp-circamotl1對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。4細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-ctl、si-circamotl1和si-linearamotl1,檢測(cè)circamotl1和amotl1mrna的表達(dá)。之后再進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)si-circamotl1對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。5pc3細(xì)胞過(guò)表達(dá)或敲低circamotl1,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài),同時(shí)進(jìn)行westernblot實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)emt標(biāo)志基因的表達(dá)。結(jié)果:1檢測(cè)環(huán)狀rna在pca組織中的表達(dá)。通過(guò)rt-pcr,在cdna組能檢測(cè)到條帶而gdna(基因組dna)組檢測(cè)不到條帶表明該環(huán)狀rna存在,并且能被擴(kuò)增出來(lái)。pcr結(jié)果顯示,circamotl1表達(dá)最明顯。隨后對(duì)circamotl1的全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增,并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳及桑格測(cè)序進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示,circamotl1全長(zhǎng)有1072個(gè)堿基,連接處序列與預(yù)測(cè)的序列一致。2Circamotl1在前列腺癌組織的表達(dá)下調(diào)。qrt-pcr結(jié)果顯示,與bph組織相比,circamotl1在pca組織中的表達(dá)水平顯著降低。熒光原位雜交結(jié)果顯示,circamotl1探針的熒光強(qiáng)度在pca組織中顯著低于bph組織,表明circamotl1在pca組織中表達(dá)下調(diào)。3Circamotl1過(guò)表達(dá)能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在正常及不同的前列腺癌細(xì)胞株中檢測(cè)circamotl1的表達(dá),qrt-pcr結(jié)果顯示,前列腺癌pc3細(xì)胞中的circamotl1表達(dá)水平明顯低于正常前列腺上皮細(xì)胞及其它癌細(xì)胞。為了研究circamotl1的功能,構(gòu)建了circamotl1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。在pc3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒gfp-circamotl1和gfp-ctl,提取rna并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)組的circamotl1表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。該結(jié)果說(shuō)明質(zhì)粒能夠成功在pc3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circamotl1。過(guò)表達(dá)circamotl1后并進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,circamotl1過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)顯著減少。創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)circAMOTL1能夠明顯降低PC3細(xì)胞的遷移能力。上述結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)circAMOTL1能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。4敲低circAMOTL1能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。PC3細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-Ctl、si-circAMOTL1和si-linear AMOTL1后,提取細(xì)胞RNA并反轉(zhuǎn)錄,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)circAMOTL1和AMOTL1mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,si-linear AMOTL1能降低circAMOTL1和AMOTL1 mRNA的水平,而si-circAMOTL1只能降低circAMOTL1的表達(dá)。該結(jié)果表明si-circAMOTL1能特異敲低circAMOTL1,而不影響線性AMOTL1的表達(dá)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,circAMOTL1敲低組的細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)明顯高于對(duì)照組。創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲低組的細(xì)胞遷移能力比對(duì)照組強(qiáng)。上述結(jié)果說(shuō)明敲低circAMOTL1能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。5 CircAMOTL1參與調(diào)控EMT。普通光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示,circAMOTL1過(guò)表達(dá)后細(xì)胞表現(xiàn)為上皮樣細(xì)胞形態(tài),而敲低circAMOTL1后細(xì)胞表現(xiàn)為間質(zhì)樣細(xì)胞形態(tài)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)circAMOTL1顯著上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin和Claudin1的表達(dá),而下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin的表達(dá)。相反,敲低circAMOTL1后上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin和Claudin1表達(dá)下調(diào),間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)上調(diào)。而兩組的β-catenin的表達(dá)水平均無(wú)明顯變化。結(jié)論:1CircAMOTL1存在于前列腺組織中,并在癌變過(guò)程中表達(dá)下調(diào)。2過(guò)表達(dá)circAMOTL1抑制而敲低circAMOTL1促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。3CircAMOTL1通過(guò)調(diào)控EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)在前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮作用。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

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1 晏濱;蔣寧;牛遠(yuǎn)杰;;前列腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制研究進(jìn)展[J];中華男科學(xué)雜志;2015年09期

2 張莉;沈麗佳;謝思明;;影響E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)因素與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)系的研究進(jìn)展[J];中外醫(yī)學(xué)研究;2014年10期

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本文編號(hào)：1633113