發(fā)布時間：2018-03-19 06:03

  本文選題：前列腺癌　切入點：環(huán)狀RNA　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤,預后較差,且容易復發(fā),對男性健康構(gòu)成嚴重威脅。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類新型非編碼RNA,大量存在于真核細胞中,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,高度保守,具有一定的組織和細胞特異性。相關(guān)研究表明circRNA與多種疾病有關(guān),特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。但是關(guān)于circRNA在前列腺癌中作用機制的研究尚無報道。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是上皮樣細胞向間質(zhì)細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變的過程,它在腫瘤的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用,但是其相關(guān)作用機制尚未研究清楚。CircRNA在EMT調(diào)控過程中的作用機制亦不清楚。本研究旨在闡明circAMOTL1在前列腺癌中的作用及其在EMT調(diào)控過程中的作用機制,為后續(xù)研究提供實驗基礎(chǔ)。通過對前列腺癌及前列腺增生組織中circRNA的篩選,發(fā)現(xiàn)circAMOTL1在前列腺癌組織中表達下調(diào);細胞實驗顯示,circAMOTL1可以調(diào)節(jié)EMT標志基因的表達。本研究將對circAMOTL1在前列腺癌中的表達及其在EMT調(diào)控過程中的作用機制進行研究,為circRNA在前列腺癌診治中的應用提供理論基礎(chǔ)。目的:闡明circAMOTL1在前列腺癌中的表達及其在EMT調(diào)控過程中的作用機制。方法:1收取PCa及前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)臨床標本,分別提取組織的RNA,及病理切片進行形態(tài)學分析。2設(shè)計環(huán)狀RNA連接處的divergent primers和convergent primers并進行PCR擴增,檢測circRNAs在前列腺組織及細胞中的表達,并對表達明顯的circRNA進行全長擴增并測序確定序列信息。同時使用circAMOTL1連接處的熒光探針對PCa組織及BPH組織進行熒光原位雜交,檢測circAMOTL1的表達差異。3利用正常前列腺上皮細胞RWPE-1細胞和前列腺癌細胞PC3細胞、lncap細胞、du145細胞的rna進行實時定量pcr,用以檢測circamotl1在前列腺非癌細胞和癌細胞中的表達差異。細胞分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒gfp-circamotl1和gfp-ctl,檢測兩組circamotl1的表達。隨后進行transwell實驗和創(chuàng)傷愈合實驗,檢測gfp-circamotl1對細胞遷移和侵襲的影響。4細胞分別轉(zhuǎn)染si-ctl、si-circamotl1和si-linearamotl1,檢測circamotl1和amotl1mrna的表達。之后再進行transwell實驗和創(chuàng)傷愈合實驗來檢測si-circamotl1對細胞遷移和侵襲的影響。5pc3細胞過表達或敲低circamotl1,然后在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài),同時進行westernblot實驗來檢測emt標志基因的表達。結(jié)果:1檢測環(huán)狀rna在pca組織中的表達。通過rt-pcr,在cdna組能檢測到條帶而gdna(基因組dna)組檢測不到條帶表明該環(huán)狀rna存在,并且能被擴增出來。pcr結(jié)果顯示,circamotl1表達最明顯。隨后對circamotl1的全長進行擴增,并通過瓊脂糖凝膠電泳及桑格測序進行鑒定,結(jié)果顯示,circamotl1全長有1072個堿基,連接處序列與預測的序列一致。2Circamotl1在前列腺癌組織的表達下調(diào)。qrt-pcr結(jié)果顯示,與bph組織相比,circamotl1在pca組織中的表達水平顯著降低。熒光原位雜交結(jié)果顯示,circamotl1探針的熒光強度在pca組織中顯著低于bph組織,表明circamotl1在pca組織中表達下調(diào)。3Circamotl1過表達能夠抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲。在正常及不同的前列腺癌細胞株中檢測circamotl1的表達,qrt-pcr結(jié)果顯示,前列腺癌pc3細胞中的circamotl1表達水平明顯低于正常前列腺上皮細胞及其它癌細胞。為了研究circamotl1的功能,構(gòu)建了circamotl1過表達質(zhì)粒。在pc3細胞中分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒gfp-circamotl1和gfp-ctl,提取rna并進行實時定量pcr。結(jié)果顯示,過表達組的circamotl1表達水平顯著高于對照組。該結(jié)果說明質(zhì)粒能夠成功在pc3細胞中過表達circamotl1。過表達circamotl1后并進行transwell實驗,結(jié)果顯示,與對照組相比,circamotl1過表達組的細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)顯著減少。創(chuàng)傷愈合實驗結(jié)果顯示,過表達circAMOTL1能夠明顯降低PC3細胞的遷移能力。上述結(jié)果說明過表達circAMOTL1能夠抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲。4敲低circAMOTL1能夠促進前列腺癌細胞的遷移和侵襲。PC3細胞分別轉(zhuǎn)染si-Ctl、si-circAMOTL1和si-linear AMOTL1后,提取細胞RNA并反轉(zhuǎn)錄,實時定量PCR檢測circAMOTL1和AMOTL1mRNA的表達。結(jié)果顯示,si-linear AMOTL1能降低circAMOTL1和AMOTL1 mRNA的水平,而si-circAMOTL1只能降低circAMOTL1的表達。該結(jié)果表明si-circAMOTL1能特異敲低circAMOTL1,而不影響線性AMOTL1的表達。Transwell實驗結(jié)果顯示,circAMOTL1敲低組的細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)明顯高于對照組。創(chuàng)傷愈合實驗結(jié)果顯示,敲低組的細胞遷移能力比對照組強。上述結(jié)果說明敲低circAMOTL1能夠促進前列腺癌細胞的遷移和侵襲。5 CircAMOTL1參與調(diào)控EMT。普通光學顯微鏡觀察結(jié)果顯示,circAMOTL1過表達后細胞表現(xiàn)為上皮樣細胞形態(tài),而敲低circAMOTL1后細胞表現(xiàn)為間質(zhì)樣細胞形態(tài)。Western blot實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,過表達circAMOTL1顯著上調(diào)上皮細胞標志蛋白E-cadherin和Claudin1的表達,而下調(diào)間質(zhì)細胞標志蛋白Vimentin的表達。相反,敲低circAMOTL1后上皮細胞標志蛋白E-cadherin和Claudin1表達下調(diào),間質(zhì)細胞標志蛋白Vimentin表達上調(diào)。而兩組的β-catenin的表達水平均無明顯變化。結(jié)論:1CircAMOTL1存在于前列腺組織中,并在癌變過程中表達下調(diào)。2過表達circAMOTL1抑制而敲低circAMOTL1促進前列腺癌細胞的遷移和侵襲。3CircAMOTL1通過調(diào)控EMT標志蛋白的表達在前列腺癌細胞的遷移和侵襲中發(fā)揮作用。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 晏濱;蔣寧;牛遠杰;;前列腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機制研究進展[J];中華男科學雜志;2015年09期

2 張莉;沈麗佳;謝思明;;影響E-鈣黏蛋白表達下調(diào)因素與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)系的研究進展[J];中外醫(yī)學研究;2014年10期

3 王永興;姜永光;;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在前列腺癌中的研究進展[J];臨床泌尿外科雜志;2011年04期

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本文編號：1633113