本文選題：肝癌　切入點(diǎn)：DNMT3b　出處：《鄭州大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肝癌人對(duì)類的健康有嚴(yán)重威脅,預(yù)后差,治療效果差,是一種致命性腫瘤。因此深入的研究肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,對(duì)加強(qiáng)肝癌的預(yù)防和治療具有重要的意義。在基因組定位中,CyclinD1基因被定位于11q13,是由295個(gè)氨基酸殘基編碼組成的蛋白質(zhì),全長(zhǎng)約15kb。該蛋白質(zhì)的蛋白分子量約為36kb。CyclinD1基因的作用機(jī)制是：CyclinD1可以通過(guò)激活CDK4導(dǎo)致pRb磷酸化,核轉(zhuǎn)錄因子E2F被釋放出來(lái),促使DNA在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制,使細(xì)胞迅速通過(guò)G1期進(jìn)入S期,結(jié)果導(dǎo)致了細(xì)胞的惡性增殖。MiRNAs是一類長(zhǎng)度約為18-25核苷酸組成的單鏈、內(nèi)源性、高度保守的非蛋白質(zhì)編碼小分子RNA。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)植物體內(nèi)具有多種miRNAs,其功能主要功能是通過(guò)抑制蛋白質(zhì)的翻譯或者降解目標(biāo)mRNA,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡與增殖：與機(jī)體代謝、個(gè)體發(fā)育等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。研究表明,miRNA可以在比較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定的存在于人類及動(dòng)物的唾液、血液、尿液等體液中,具有調(diào)控細(xì)胞分化、發(fā)育、凋亡及增殖等作用。某些miRNAs具有抑制腫瘤的作用,某些miRNAs具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用參與腫瘤的演變與形成[14-16]。已有研究證實(shí),miR-145在腫瘤中是抑癌基因,在肝癌細(xì)胞系中異常表達(dá),并且在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中占據(jù)重要作用。在分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域,我們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到表遺傳學(xué)(Epigenetics)的改變往往是由腫瘤基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控導(dǎo)致的；我們?cè)絹?lái)越重視這種不改變基因編碼序列,并且是可逆的表遺傳學(xué)調(diào)節(jié)。大量的研究表明,腫瘤的發(fā)生是由多種腫瘤基因、腫瘤抑制基因的功能改變組成的多步驟過(guò)程,表遺傳學(xué)或／和遺傳學(xué)的改變都可以引起腫瘤的發(fā)生。惡性腫瘤的發(fā)生一般都伴有腫瘤抑制基因的功能喪失。由DNMT3b催化完成的DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化是DNA的一種重要的修飾方法,是表遺傳學(xué)重要內(nèi)容,DNA甲基化的修飾在基因的表達(dá)調(diào)控、X染色體失活、基因組印記、胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生等許多方面發(fā)揮著重要的作用。DNMT3b是DNMTs家族中作用最重要的一員。在未分化的胚胎干細(xì)胞可以檢測(cè)到DNMT3b的大量表達(dá),主要催化DNA的甲基化,在正常人體的細(xì)胞中表達(dá)量很低。DNA甲基化調(diào)控主要通過(guò)改變基因啟動(dòng)子區(qū)域的CPG島的甲基化狀態(tài)實(shí)現(xiàn)�；騿�(dòng)子區(qū)域有大約50%的CPG島位。在正常細(xì)胞中,位于基因啟動(dòng)子區(qū)域的大部分CPG島是低甲基化狀態(tài)。在惡性腫瘤細(xì)胞中,DNMT3b的高表達(dá)可以使某些腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)CPG島處于高甲基化狀態(tài),進(jìn)而使該基因功能沉默,從而引起了腫瘤的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在肝癌細(xì)胞系中,Cyclin-D1基因(一重要的癌基因)的表達(dá)明顯升高,我們采用siRNA技術(shù)抑制DNMT3b的表達(dá)后,Cyclin-D1基因的表達(dá)同時(shí)降低,在這一過(guò)程中,Cyclin-D1基因的啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)不變。在這一過(guò)程中,如果DNMT3b通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶的作用的話,那么抑制DNMT3b的表達(dá)應(yīng)該使CyclinD1基因表達(dá)應(yīng)該升高,而我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在此過(guò)程中,CyclinD1基因表達(dá)是降低的,而其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平不變。那么究竟是什么原因引起了CyclinD1基因表達(dá)的改變呢?本實(shí)驗(yàn)將對(duì)此問(wèn)題作出回答。第一部分：方法1、通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)SMMC7721細(xì)胞；將DNMT3b siRNA(終濃度為50nnM)轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系SMMC7721中；2、研究分組研究分為轉(zhuǎn)染control siRNA的對(duì)照組和轉(zhuǎn)染DNMT3b siRNA的實(shí)驗(yàn)組。3、siRNA轉(zhuǎn)染將常規(guī)培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行傳代,接種于六孔板上；然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。4、用日本Nikon公司顯微熒光攝像/照相系統(tǒng)檢測(cè)熒光素標(biāo)記的對(duì)照siRNA在SMMC7721細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率并照相。5、轉(zhuǎn)染后48h分別提取兩組細(xì)胞的基因組DNA。提取總蛋白。6、用Western blotting方法檢測(cè)DNMT3b和CyclinD 1在轉(zhuǎn)染前后的表達(dá)變化。7、甲基化特異性PCR (MS-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后CyclinD 1基因組啟動(dòng)子區(qū)DNA的甲基化狀態(tài)的變化。結(jié)果1、肝癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后被顯著抑制。將熒光素標(biāo)記的對(duì)照siRNA,在同樣條件下轉(zhuǎn)染到SMMC7721細(xì)胞中,置37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)48h,通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的效率可達(dá)90%以上。2、用Western blotting方法檢測(cè)DNMT3b和CyclinD 1顯示轉(zhuǎn)染siRNA后,實(shí)驗(yàn)組的DNMT3b和CyclinD的表達(dá)水平明顯低降,而對(duì)照組和正常組DNMT3b和CyclinD 1的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。3、通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn),在轉(zhuǎn)染DNMT3b siRNA后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的增殖活性在48和72小時(shí)均有顯著性差異。4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)SMMC7721細(xì)胞在轉(zhuǎn)染DNMT3b siRNA的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組細(xì)胞,同時(shí)S期的細(xì)胞則明顯減少。5、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞中CyclinD 1基因均表現(xiàn)為低甲基化,甲基化狀態(tài)無(wú)明顯差異,M引物未擴(kuò)增出目的片段,U引物擴(kuò)增出目的片段,兩組細(xì)胞中CyclinD 1基因甲基化狀態(tài)未發(fā)生改變。第二部分方法1、SMMC7721細(xì)胞培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染DNMT3bsiRNA,2、轉(zhuǎn)染后48h分別提取兩組細(xì)胞的基因組DNA及總RNA。3、用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后miR- 145RNA以及CyclinD1mRNA的表達(dá)變化。4、檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后miR-145基因組啟動(dòng)子區(qū)DNA的甲基化狀態(tài)的變化。結(jié)果1、我們看到實(shí)驗(yàn)組miR-145RNA在轉(zhuǎn)染前低表達(dá),轉(zhuǎn)染后miR-145RNA高表達(dá)；在對(duì)照組轉(zhuǎn)染前后miR-145RNA的表達(dá)狀態(tài)不變,均為低表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組在轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后CyclinD1 mRNA的表達(dá)均未發(fā)生明顯改變,均為高表達(dá)。2、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞中miR-145基因均表現(xiàn)為低甲基化,甲基化狀態(tài)無(wú)明顯差異,M引物未擴(kuò)增出目的片段,U引物擴(kuò)增出目的片段,兩組細(xì)胞中miR-145基因甲基化狀態(tài)未發(fā)生改變。結(jié)論DNMT3b siRNA可以特異地抑制DNMT3b的表達(dá)。DNMT3b可以通過(guò)調(diào)控miR-145的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控CyclinD1基因表達(dá)。該過(guò)程中miR-145基因及CyclinD1基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)未發(fā)生改變。這說(shuō)明DNMT3b在此過(guò)程中并未發(fā)揮DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用。DNMT3b的表達(dá)變化通過(guò)引起miR-145的高表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的低表達(dá),使腫瘤細(xì)胞停滯在G1期,從而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖,表明DNMT3b可以成為肝癌基因治療中的一個(gè)重要分子靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1630181