本文選題：LncRNA　切入點(diǎn)：基因芯片　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分LncRNA在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)譜分析目的:為探討甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用微陣列芯片技術(shù)觀察長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)譜,并分析長(zhǎng)鏈非編碼RNA及mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織與無瘤甲狀腺組織中的表達(dá)是否存在差異。方法:收集2014年4月~2014年11月在唐山市工人醫(yī)院手術(shù)切除的36例甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁無瘤甲狀腺組織標(biāo)本,所有病例均經(jīng)病理診斷證實(shí),且均為首次發(fā)病初次手術(shù),術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療和其他針對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的治療。所有組織離體后立即置于液氮中,保存于唐山市工人醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。選擇3例甲狀腺乳頭狀癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁無瘤甲狀腺組織,應(yīng)用微陣列芯片技術(shù)完成長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)譜的檢測(cè)。其余33例應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)隨機(jī)選取的8條差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,用于表達(dá)譜芯片結(jié)果的驗(yàn)證。芯片結(jié)果掃描圖要求信號(hào)均勻,清晰,沒有邊緣化效應(yīng)、刮傷等影響信號(hào)值,陽性定位點(diǎn)和陰性對(duì)照區(qū)域結(jié)果明顯。芯片標(biāo)準(zhǔn)化后分析差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA和差異表達(dá)mRNAs,篩選基準(zhǔn)為2倍差異,進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行GO分析及KEGG通路分析,還對(duì)差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA進(jìn)行了亞組分析及與相應(yīng)mRNAs聯(lián)合分析。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。組間差異采用t檢驗(yàn),P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)譜芯片分析顯示,甲狀腺乳頭狀癌組織與癌旁無瘤甲狀腺組織相比,長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)譜存在顯著差異。與無瘤甲狀腺組織相比,甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)差異具有2倍以上的長(zhǎng)鏈非編碼RNA有675條,其中上調(diào)的有312條,下調(diào)的有363條(P0.05);具有2倍以上差異的mRNAs有751條,其中上調(diào)的有499條,下調(diào)的有252條(P0.05)。2go分析包括分子功能(molecularfunction),生物過程(biologicalprocess)和細(xì)胞組分(cellularcomponent)三部分,與癌旁無瘤甲狀腺組織比,甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)下調(diào)的基因中,與分子功能相關(guān)的基因有170個(gè),與生物過程相關(guān)的有159個(gè),與細(xì)胞組分相關(guān)的有187個(gè)。分子功能中占比例最大的為oxygentransporteractivity(氧轉(zhuǎn)運(yùn)體活性),生物過程中占比例最大的為negativeregulationoftransporteractivity(轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性負(fù)調(diào)控),細(xì)胞組分中占比例最大的為myofibril(肌原纖維)。上調(diào)的基因中與分子功能相關(guān)的基因有359個(gè),與生物過程相關(guān)的有362個(gè),與細(xì)胞組分相關(guān)的有376個(gè)。分子功能中占比例最大的為proteinbinding(蛋白結(jié)合),生物過程中占比例最大的為responsetostimulus(對(duì)刺激反應(yīng)),細(xì)胞組分中占比例最大的為plasmamembranepart(質(zhì)膜部分)。3kegg通路分析顯示下調(diào)信號(hào)通路有7條,最明顯的為“fcepsilonrisignalingpathway-homosapiens(human)”通路,上調(diào)信號(hào)通路有29條,最明顯的為“p53signalingpathway-homosapiens(human)”通路。4對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼rna進(jìn)行亞組分析及與相應(yīng)mrnas聯(lián)合分析,結(jié)果顯示:與癌旁無瘤甲狀腺組織相比,甲狀腺乳頭狀癌組織中有7對(duì)enhancer-likelncrna-mrna,9對(duì)antisenselncrna-mrna和45對(duì)lincrna-mrna表達(dá)有明顯差異。5real-timepcr檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁無瘤甲狀腺組織中表達(dá)有差異的隨機(jī)挑選的8條長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000503723、enst00000423539、uc003tab.3、nr_073085、enst00000515275、enst00000570022、uc003qef.1和enst00000427243的表達(dá)水平。real-timepcr結(jié)果分析與芯片結(jié)果相一致。說明基因芯片的結(jié)果是可靠的。第二部分lncrnaenst00000423539在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)分析目的:探討長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)變化,并分析其與臨床特征之間的關(guān)系。方法:收集2014年4月~2014年11月在唐山市工人醫(yī)院手術(shù)切除的57例甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁無瘤甲狀腺組織標(biāo)本,其中男性患者17名,女性患者40名,年齡在17至68歲之間,所有病例均經(jīng)病理診斷證實(shí),且均為首次發(fā)病初次手術(shù),術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療和其他針對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的治療。所有組織離體后立即置于液氮中,保存于唐山市工人醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。采用real-timepcr方法檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁無瘤甲狀腺組織中長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539的表達(dá)水平。real-timepcr實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△ct法進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)由spss13.0軟件處理,兩組間長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539的表達(dá)水平比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539的表達(dá)水平與臨床一般指標(biāo)之間的比較采用卡方檢驗(yàn),臨床一般指標(biāo)包括年齡,性別,腫瘤分期,腫瘤大小,是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及是否多發(fā)。p0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1與無瘤甲狀腺組織相比,甲狀腺乳頭狀癌組織中的長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539的表達(dá)水平明顯升高(p0.05),甲狀腺癌組織與無瘤甲狀腺組織相比,長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539的表達(dá)水平比值大于2倍的有36例。2甲狀腺乳頭狀癌組織中長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539的表達(dá)水平與臨床一般指標(biāo)之間的關(guān)系比較發(fā)現(xiàn),甲狀腺乳頭狀癌患者長(zhǎng)鏈非編rnaenst00000423539表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(p0.05)。長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539表達(dá)水平高低與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期及是否多發(fā)無關(guān)。第三部分抑制lncrnaenst00000423539表達(dá)對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌k1細(xì)胞影響的體外研究目的:應(yīng)用rna干擾技術(shù),抑制長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539在甲狀腺乳頭狀癌k1細(xì)胞中的表達(dá),分析長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539對(duì)甲狀腺乳頭狀癌k1細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響,為以長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539為靶點(diǎn)的甲狀腺乳頭狀癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:設(shè)計(jì)并合成2對(duì)靶向沉默人長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539的小干擾rna(sirna-302,sirna-344)和negativecontrol(nc-sirna)轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌k1細(xì)胞,分組如下:control組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染的k1細(xì)胞),nc組(轉(zhuǎn)染非特異性sirna的k1細(xì)胞),exp1組(轉(zhuǎn)染enst00000423539-sirna-302的k1細(xì)胞),exp2組(轉(zhuǎn)染enst00000423539-sirna-344的k1細(xì)胞)。采用real-timepcr方法檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539在各組中的表達(dá)水平并篩選出最有效的sirna。應(yīng)用有效的sirna沉默長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539在甲狀腺乳頭狀癌k1細(xì)胞中的表達(dá),分組如下:control組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染的k1細(xì)胞),nc組(轉(zhuǎn)染非特異性sirna的k1細(xì)胞),exp組(轉(zhuǎn)染有效enst00000423539-sirna的k1細(xì)胞),對(duì)轉(zhuǎn)染完成的甲狀腺乳頭狀癌k1細(xì)胞行平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化,行transwell侵襲實(shí)驗(yàn),觀察抑制長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539后k1細(xì)胞侵襲能力的改變。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)由spss13.0軟件處理,組間比較采用方差分析,p0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:12對(duì)sirna中,enst00000423539-sirna-344能有效干擾長(zhǎng)鏈非編碼rnaenst00000423539在甲狀腺乳頭狀癌k1細(xì)胞中的表達(dá),干擾效率超70%(p0.05)。nc組與control組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2行平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染2周后,轉(zhuǎn)染enst00000423539-sirna-344組克隆形成率55±5%,control組與nc組克隆形成率96±4%和95±4%,exp組較control組及nc組克隆形成數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),轉(zhuǎn)染enst00000423539-sirna-344后的甲狀腺乳頭狀癌k1細(xì)胞增殖明顯受限。3在transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中,control組、nc組、exp組,每個(gè)視野甲狀腺乳頭狀癌k1細(xì)胞數(shù)分別為(57±3.4),(55±4.5),(27±4.3),exp組甲狀腺乳頭狀癌k1細(xì)胞穿過ecm膠的數(shù)量與對(duì)照組比明顯降低,轉(zhuǎn)染enst00000423539-sirna-344后的甲狀腺乳頭狀癌k1細(xì)胞侵襲能力明顯降低(p0.05)。結(jié)論:1人類長(zhǎng)鏈非編碼rna表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,在甲狀腺組織中有大量長(zhǎng)鏈非編碼rna轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生。進(jìn)一步分析顯示與無瘤甲狀腺組織相比,在甲狀腺乳頭狀癌組織中存在675條表達(dá)異常的長(zhǎng)鏈非編碼rna,其中上調(diào)的有312條,下調(diào)的有363條。2表達(dá)譜芯片結(jié)果還顯示甲狀腺乳頭狀癌組織與癌旁無瘤甲狀腺組織相比mrna的含量也存在顯著性差異,長(zhǎng)鏈非編碼rna與mrna聯(lián)合分析,甲狀腺乳頭狀癌組織存在61對(duì)表達(dá)異常的lncRNA-mRNA。3 Real-time PCR檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌組織及無瘤組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)結(jié)果與芯片結(jié)果相一致,芯片結(jié)果是可靠的。4甲狀腺乳頭狀癌組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000423539的表達(dá)水平明顯升高,且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),提示長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000423539參與甲狀腺乳頭狀癌腫瘤的轉(zhuǎn)移。5靶向抑制人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞的長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000423539表達(dá),可以抑制人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞的增殖能力及侵襲能力,說明長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000423539參與了甲狀腺乳頭狀癌的增殖及侵襲過程,沉默長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000423539基因有望應(yīng)用于甲狀腺乳頭狀癌的靶向治療。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R736.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1628845