本文選題：LncRNA　切入點：基因芯片　出處：《河北醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分LncRNA在甲狀腺乳頭狀癌中的表達譜分析目的:為探討甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病機制,本實驗應用微陣列芯片技術觀察長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達譜,并分析長鏈非編碼RNA及mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織與無瘤甲狀腺組織中的表達是否存在差異。方法:收集2014年4月~2014年11月在唐山市工人醫(yī)院手術切除的36例甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁無瘤甲狀腺組織標本,所有病例均經(jīng)病理診斷證實,且均為首次發(fā)病初次手術,術前均未進行化療、放療和其他針對甲狀腺乳頭狀癌的治療。所有組織離體后立即置于液氮中,保存于唐山市工人醫(yī)院中心實驗室。選擇3例甲狀腺乳頭狀癌組織及對應癌旁無瘤甲狀腺組織,應用微陣列芯片技術完成長鏈非編碼RNA表達譜的檢測。其余33例應用Real-time PCR方法檢測隨機選取的8條差異表達的長鏈非編碼RNA,用于表達譜芯片結(jié)果的驗證。芯片結(jié)果掃描圖要求信號均勻,清晰,沒有邊緣化效應、刮傷等影響信號值,陽性定位點和陰性對照區(qū)域結(jié)果明顯。芯片標準化后分析差異表達的長鏈非編碼RNA和差異表達mRNAs,篩選基準為2倍差異,進一步對差異表達mRNAs進行GO分析及KEGG通路分析,還對差異表達的長鏈非編碼RNA進行了亞組分析及與相應mRNAs聯(lián)合分析。Real-time PCR實驗數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進行分析。組間差異采用t檢驗,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1長鏈非編碼RNA表達譜芯片分析顯示,甲狀腺乳頭狀癌組織與癌旁無瘤甲狀腺組織相比,長鏈非編碼RNA表達譜存在顯著差異。與無瘤甲狀腺組織相比,甲狀腺乳頭狀癌中表達差異具有2倍以上的長鏈非編碼RNA有675條,其中上調(diào)的有312條,下調(diào)的有363條(P0.05);具有2倍以上差異的mRNAs有751條,其中上調(diào)的有499條,下調(diào)的有252條(P0.05)。2go分析包括分子功能(molecularfunction),生物過程(biologicalprocess)和細胞組分(cellularcomponent)三部分,與癌旁無瘤甲狀腺組織比,甲狀腺乳頭狀癌組織中表達下調(diào)的基因中,與分子功能相關的基因有170個,與生物過程相關的有159個,與細胞組分相關的有187個。分子功能中占比例最大的為oxygentransporteractivity(氧轉(zhuǎn)運體活性),生物過程中占比例最大的為negativeregulationoftransporteractivity(轉(zhuǎn)運蛋白活性負調(diào)控),細胞組分中占比例最大的為myofibril(肌原纖維)。上調(diào)的基因中與分子功能相關的基因有359個,與生物過程相關的有362個,與細胞組分相關的有376個。分子功能中占比例最大的為proteinbinding(蛋白結(jié)合),生物過程中占比例最大的為responsetostimulus(對刺激反應),細胞組分中占比例最大的為plasmamembranepart(質(zhì)膜部分)。3kegg通路分析顯示下調(diào)信號通路有7條,最明顯的為“fcepsilonrisignalingpathway-homosapiens(human)”通路,上調(diào)信號通路有29條,最明顯的為“p53signalingpathway-homosapiens(human)”通路。4對長鏈非編碼rna進行亞組分析及與相應mrnas聯(lián)合分析,結(jié)果顯示:與癌旁無瘤甲狀腺組織相比,甲狀腺乳頭狀癌組織中有7對enhancer-likelncrna-mrna,9對antisenselncrna-mrna和45對lincrna-mrna表達有明顯差異。5real-timepcr檢測甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁無瘤甲狀腺組織中表達有差異的隨機挑選的8條長鏈非編碼rnaenst00000503723、enst00000423539、uc003tab.3、nr_073085、enst00000515275、enst00000570022、uc003qef.1和enst00000427243的表達水平。real-timepcr結(jié)果分析與芯片結(jié)果相一致。說明基因芯片的結(jié)果是可靠的。第二部分lncrnaenst00000423539在甲狀腺乳頭狀癌中的表達分析目的:探討長鏈非編碼rnaenst00000423539在甲狀腺乳頭狀癌中表達變化,并分析其與臨床特征之間的關系。方法:收集2014年4月~2014年11月在唐山市工人醫(yī)院手術切除的57例甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁無瘤甲狀腺組織標本,其中男性患者17名,女性患者40名,年齡在17至68歲之間,所有病例均經(jīng)病理診斷證實,且均為首次發(fā)病初次手術,術前均未進行化療、放療和其他針對甲狀腺乳頭狀癌的治療。所有組織離體后立即置于液氮中,保存于唐山市工人醫(yī)院中心實驗室。采用real-timepcr方法檢測甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁無瘤甲狀腺組織中長鏈非編碼rnaenst00000423539的表達水平。real-timepcr實驗數(shù)據(jù)采用2-△△ct法進行分析。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計由spss13.0軟件處理,兩組間長鏈非編碼rnaenst00000423539的表達水平比較采用配對t檢驗,長鏈非編碼rnaenst00000423539的表達水平與臨床一般指標之間的比較采用卡方檢驗,臨床一般指標包括年齡,性別,腫瘤分期,腫瘤大小,是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及是否多發(fā)。p0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1與無瘤甲狀腺組織相比,甲狀腺乳頭狀癌組織中的長鏈非編碼rnaenst00000423539的表達水平明顯升高(p0.05),甲狀腺癌組織與無瘤甲狀腺組織相比,長鏈非編碼rnaenst00000423539的表達水平比值大于2倍的有36例。2甲狀腺乳頭狀癌組織中長鏈非編碼rnaenst00000423539的表達水平與臨床一般指標之間的關系比較發(fā)現(xiàn),甲狀腺乳頭狀癌患者長鏈非編rnaenst00000423539表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(p0.05)。長鏈非編碼rnaenst00000423539表達水平高低與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期及是否多發(fā)無關。第三部分抑制lncrnaenst00000423539表達對人甲狀腺乳頭狀癌k1細胞影響的體外研究目的:應用rna干擾技術,抑制長鏈非編碼rnaenst00000423539在甲狀腺乳頭狀癌k1細胞中的表達,分析長鏈非編碼rnaenst00000423539對甲狀腺乳頭狀癌k1細胞增殖、侵襲能力的影響,為以長鏈非編碼rnaenst00000423539為靶點的甲狀腺乳頭狀癌治療提供實驗依據(jù)。方法:設計并合成2對靶向沉默人長鏈非編碼rnaenst00000423539的小干擾rna(sirna-302,sirna-344)和negativecontrol(nc-sirna)轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌k1細胞,分組如下:control組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染的k1細胞),nc組(轉(zhuǎn)染非特異性sirna的k1細胞),exp1組(轉(zhuǎn)染enst00000423539-sirna-302的k1細胞),exp2組(轉(zhuǎn)染enst00000423539-sirna-344的k1細胞)。采用real-timepcr方法檢測長鏈非編碼rnaenst00000423539在各組中的表達水平并篩選出最有效的sirna。應用有效的sirna沉默長鏈非編碼rnaenst00000423539在甲狀腺乳頭狀癌k1細胞中的表達,分組如下:control組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染的k1細胞),nc組(轉(zhuǎn)染非特異性sirna的k1細胞),exp組(轉(zhuǎn)染有效enst00000423539-sirna的k1細胞),對轉(zhuǎn)染完成的甲狀腺乳頭狀癌k1細胞行平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力的變化,行transwell侵襲實驗,觀察抑制長鏈非編碼rnaenst00000423539后k1細胞侵襲能力的改變。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計由spss13.0軟件處理,組間比較采用方差分析,p0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:12對sirna中,enst00000423539-sirna-344能有效干擾長鏈非編碼rnaenst00000423539在甲狀腺乳頭狀癌k1細胞中的表達,干擾效率超70%(p0.05)。nc組與control組相比差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。2行平板克隆形成實驗顯示,轉(zhuǎn)染2周后,轉(zhuǎn)染enst00000423539-sirna-344組克隆形成率55±5%,control組與nc組克隆形成率96±4%和95±4%,exp組較control組及nc組克隆形成數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),轉(zhuǎn)染enst00000423539-sirna-344后的甲狀腺乳頭狀癌k1細胞增殖明顯受限。3在transwell侵襲實驗中,control組、nc組、exp組,每個視野甲狀腺乳頭狀癌k1細胞數(shù)分別為(57±3.4),(55±4.5),(27±4.3),exp組甲狀腺乳頭狀癌k1細胞穿過ecm膠的數(shù)量與對照組比明顯降低,轉(zhuǎn)染enst00000423539-sirna-344后的甲狀腺乳頭狀癌k1細胞侵襲能力明顯降低(p0.05)。結(jié)論:1人類長鏈非編碼rna表達譜芯片結(jié)果顯示,在甲狀腺組織中有大量長鏈非編碼rna轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生。進一步分析顯示與無瘤甲狀腺組織相比,在甲狀腺乳頭狀癌組織中存在675條表達異常的長鏈非編碼rna,其中上調(diào)的有312條,下調(diào)的有363條。2表達譜芯片結(jié)果還顯示甲狀腺乳頭狀癌組織與癌旁無瘤甲狀腺組織相比mrna的含量也存在顯著性差異,長鏈非編碼rna與mrna聯(lián)合分析,甲狀腺乳頭狀癌組織存在61對表達異常的lncRNA-mRNA。3 Real-time PCR檢測甲狀腺乳頭狀癌組織及無瘤組織中長鏈非編碼RNA表達結(jié)果與芯片結(jié)果相一致,芯片結(jié)果是可靠的。4甲狀腺乳頭狀癌組織中長鏈非編碼RNA ENST00000423539的表達水平明顯升高,且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關,提示長鏈非編碼RNA ENST00000423539參與甲狀腺乳頭狀癌腫瘤的轉(zhuǎn)移。5靶向抑制人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞的長鏈非編碼RNA ENST00000423539表達,可以抑制人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞的增殖能力及侵襲能力,說明長鏈非編碼RNA ENST00000423539參與了甲狀腺乳頭狀癌的增殖及侵襲過程,沉默長鏈非編碼RNA ENST00000423539基因有望應用于甲狀腺乳頭狀癌的靶向治療。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R736.1

【參考文獻】

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