本文選題：全外顯子測序　切入點：散發(fā)性完全性葡萄胎　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：完全性葡萄胎(Complete hydatidiform mole,CHM)是一種具有惡變傾向的良性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病。流行病學(xué)的數(shù)據(jù)顯示,完全性葡萄胎的種族或地域分布存在明顯差異,這提示其發(fā)病可能與親代的遺傳有關(guān)�，F(xiàn)階段的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),葡萄胎是雄性基因表達(dá)過度導(dǎo)致的,完全性葡萄胎是單獨雄性基因表達(dá)的結(jié)果;雙親來源葡萄胎發(fā)病與母系印跡基因突變的關(guān)系已有所揭示,但迄今對非家族性復(fù)發(fā)性完全性葡萄胎(散發(fā)性葡萄胎)中母系基因的缺失與母系遺傳背景的關(guān)系幾乎一無所知。近幾年,測序技術(shù)的高速進(jìn)展,讓在芯片的高通量技術(shù)上發(fā)展的測序技術(shù),即二代測序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)應(yīng)時出世。芯片技術(shù)的形成成功地提升了發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的及個體相關(guān)的基因突變的水平。全外顯子組測序(whole exome sequencing,WES)是憑借人類基因組中外顯子區(qū)的蛋白質(zhì)編碼序列(coding sequence)為目標(biāo)的第二代測序技術(shù),存在于外顯子組(exome)的序列甚至都沒有人類整個基因組序列的1%,但在已有研究發(fā)現(xiàn)及文獻(xiàn)報道的人類的單基因遺傳病中,其中85%的致病突變位點是位于外顯子區(qū)域的。已有研究顯示,WES能發(fā)現(xiàn)個體家族性遺傳疾病和一些具有復(fù)雜性狀的遺傳病的低頻突變,提示利用該技術(shù)有助于篩查和發(fā)現(xiàn)葡萄胎發(fā)病相關(guān)的易感基因。絨毛膜癌(簡稱絨癌,Choriocarcinoma)是一種來源于胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞的高度惡性腫瘤,繼發(fā)于葡萄胎、流產(chǎn)或足月分娩。與其它惡性腫瘤相比,不同的是它極易通過血道,在很早期便可轉(zhuǎn)移至全身,而其它腫瘤往往晚期才發(fā)生血運轉(zhuǎn)移。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),葡萄胎遺傳易感基因MIIP與這種惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的早期轉(zhuǎn)移的行為關(guān)系迄今為止未被研究。本研究應(yīng)用全外顯子測序?qū)︻净纪耆云咸烟ズ鸵延幸淮握Ｈ焉锏闹袊鴿h族婦女進(jìn)行可能的易感基因突變篩查。再通過生物學(xué)信息分析后,獲得候選易感基因,同時進(jìn)一步通過能精確檢測及驗證的單堿基延伸和激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行二次篩查。最后將對候選易感基因,進(jìn)行金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測序的驗證。在此基礎(chǔ)上,通過查閱文獻(xiàn),了解部分易感基因的功能,選擇對調(diào)控細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為MIIP基因,在絨癌細(xì)胞中進(jìn)行體外基因功能實驗及機(jī)制探究。旨在了解完全性葡萄胎發(fā)病易感基因和及其對絨癌惡性生物學(xué)行為的作用。第一部分 通過全外顯子測序技術(shù)揭示完全性葡萄胎中ERC1及KCNG4突變的遺傳易感性目的:篩查母系遺傳背景在母系基因缺失的非家族性復(fù)發(fā)性完全性葡萄胎中可能遺傳易感基因。方法:通過二代測序技術(shù)(NGS)方法中的全外顯子組測序技術(shù)(WES),對51例非家族性復(fù)發(fā)性完全性葡萄胎患者及47例已分娩一次的正常孕婦的外周血DNA進(jìn)行遺傳易感性的篩查。再通過單堿基延伸[Single base extension,SBE]和激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)[Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS]在 199 例完全性葡萄胎患者和 400 例正常對照中進(jìn)行二次篩查,最后將對候選易感基因,在247例完全性葡萄胎患者及599例正常對照女性(包含205例新增的對照樣本)中進(jìn)行金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測序的驗證。通過查閱當(dāng)前文獻(xiàn),推測易感基因與非家族性復(fù)發(fā)性完全性葡萄胎的可能形成機(jī)理。結(jié)果:1、在全外顯子篩查時,發(fā)現(xiàn)了 398,594單核苷酸突變位點,其中罕見的有害突變位點有5301個,罕見突變中包含了 2,033個單位點突變基因和1,054個多位點突變基因2、在Mass-ARRAY進(jìn)行二次篩查后,發(fā)現(xiàn)有三個基因位點可能與散發(fā)性的完全性葡萄胎的發(fā)生有關(guān),它們分別是ERC1中的c.G48C(p.Q16H)(p=0.01244),KCNG4 中的 c.Gl 114A(p.G372S)(p=0.01156)和 MMIIP 中的 c.C739T(p.R247W)(p=0.023152)3、進(jìn)行擴(kuò)大樣本驗證后,ERC1 中的 c.G48C(p.Q16H)(p=0.0008361),KCNG4中的c.G1114A(p.G372S)(p=0.017728)統(tǒng)計學(xué)意義仍然明顯。結(jié)論:1、ERC1 的 c.G48C(p.Q16H)位點和 KCNG4 的 c.G1114A(p.G372S)位點,這兩個位點可能增加完全性葡萄胎的發(fā)生幾率(p0.05).2、ERC1和KCNG4可能影響減數(shù)分裂時中心體的牽拉作用,進(jìn)而影響卵細(xì)胞的減數(shù)分裂過程第二部分MIIP基因?qū)q癌細(xì)胞生物學(xué)功能影響及可能的相關(guān)機(jī)制的研究目的:明確MIIP對絨毛膜癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移及裸鼠荷瘤能力等生物學(xué)行為的調(diào)控作用及其可能的相關(guān)通路機(jī)制。方法:采用實時熒光定量 PCR(quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)法檢測MIIP在女性生殖器相關(guān)組織中的mRNA水平,及在絨癌細(xì)胞系和正常滋養(yǎng)細(xì)胞模型的細(xì)胞系中的mRNA水平。利用Western-blot技術(shù)檢測蛋白水平的表達(dá)。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)分別在絨癌細(xì)胞株JAR和JEG-3中轉(zhuǎn)染MIIP慢病毒干擾序列或陰性對照下調(diào)MIIP的表達(dá),在正常滋養(yǎng)細(xì)胞模型的細(xì)胞株SWAN中轉(zhuǎn)染MIIP表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)MIIP的表達(dá),分別通過CCK-8法檢測腫瘤細(xì)胞的增殖能力、流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、傷口愈合實驗和Transwell聯(lián)合或不聯(lián)合matrigel實驗檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力,通過裸鼠荷瘤實驗檢測細(xì)胞的荷瘤能力。通過Western blot檢測MIIP在細(xì)胞內(nèi)可能基因的相關(guān)通路。結(jié)果:1.干擾MIIP的表達(dá)促進(jìn)絨癌細(xì)胞株JAR和JEG-3細(xì)胞的增殖能力,促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力,對細(xì)胞凋亡無明顯影響。2、正常滋養(yǎng)細(xì)胞模型細(xì)胞株SWAN中上調(diào)MIIP的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞侵襲和遷移,對細(xì)胞凋亡無明顯影響。3、低表達(dá)MIIP基因,對絨癌細(xì)胞株JAR細(xì)胞的荷瘤能力有增強(qiáng)作用。4.調(diào)控MIIP可改變HDAC6和乙�；�-tubulin表達(dá)。結(jié)論:1、改變MIIP表達(dá)可影響滋養(yǎng)細(xì)胞的部分生物學(xué)行為,在絨癌細(xì)胞中MIIP發(fā)揮抑癌功能。2、HDAC6和乙酰化α-tubulin可能參與MIIP對絨癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

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本文編號：1628279