本文選題：結(jié)直腸癌　切入點(diǎn)：B7-H4　出處：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：結(jié)直腸癌是常見的十大惡性腫瘤之一,已成為世界男性第三位、女性第二位高發(fā)的惡性腫瘤。雖然常規(guī)的臨床治療手段如手術(shù)、放療和化療等使患者生存率得到了一定程度的提高,但晚期患者的治療效果仍不理想。因此,進(jìn)一步探討腫瘤免疫調(diào)控的機(jī)制,尋找新的干預(yù)靶點(diǎn),業(yè)已成為領(lǐng)域重要課題。腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有著極為重要的作用,腫瘤細(xì)胞通過其表面表達(dá)的分子與周圍細(xì)胞及細(xì)胞因子相互作用,相互影響,逃避機(jī)體免疫監(jiān)視,以形成腫瘤免疫逃逸、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移。而負(fù)性B7家族共刺激分子B7-H4是腫瘤微環(huán)境及介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的重要免疫卡控點(diǎn)分子。業(yè)已表明,B7-H4可通過抑制T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞的免疫應(yīng)答,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移。臨床研究表明,B7-H4可以組成性表達(dá)于多種腫瘤組織,與疾病的不良預(yù)后密切相關(guān)。已有研究主要集中在B7-H4在腫瘤組織中的異常表達(dá)、臨床意義以及其負(fù)性作用上,但B7-H4分子在腫瘤在組織中異常表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。蛋白激酶C(PKC)是一類廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶,在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖調(diào)控以及腫瘤的發(fā)生中起重要作用。PKC是結(jié)腸細(xì)胞生長與分化的重要調(diào)節(jié)器,化學(xué)致癌模型已廣泛被用于解釋信號異常,而這種異常會引起結(jié)直腸惡性變。鑒于PKC信號在調(diào)控細(xì)胞表達(dá)中發(fā)揮了重要作用,本研究以PKC信號可能參與調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌中B7-H4表達(dá)切入,進(jìn)一步探討結(jié)直腸癌中B7-H4異常表達(dá)的臨床意義及PKC對其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。第一部分PKC信號對結(jié)直腸癌細(xì)胞B7-H4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用【目的】檢測佛波酯(TPA)及PD98059對結(jié)直腸癌細(xì)胞株B7-H4基因及蛋白表達(dá)的影響,初步探討PKC信號對結(jié)直腸癌細(xì)胞B7-H4異常表達(dá)可能的調(diào)節(jié)作用�！痉椒ā勘狙芯渴占�11例新鮮結(jié)直腸癌組織、5例炎性息肉及6例癌旁正常組織,半定量-PCR及免疫組化檢測不同腸組織中B7-H4表達(dá)水平。應(yīng)用TPA誘導(dǎo)HCT116及SW480細(xì)胞,利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和流式細(xì)胞分選試驗(yàn)(FCM)檢測處理組與對照組細(xì)胞B7-H4基因及蛋白水平變化,觀察它們在TPA不同濃度及不同時(shí)相作用下B7-H4m RNA水平變化、細(xì)胞膜表面及胞漿內(nèi)B7-H4蛋白表達(dá)的變化。PKC下游信號阻斷劑PD98059作用于HCT116細(xì)胞后,PCR法和FCM檢測細(xì)胞中B7-H4的表達(dá)變化�！窘Y(jié)果】RT-PCR法檢測腸組織中B7-H4 m RNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示11例結(jié)直腸癌組織中有7例癌組織B7-H4表達(dá)水平明顯增高,而在6例癌旁組織和5例腸息肉中僅發(fā)現(xiàn)1例表達(dá)水平增高。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPA(50、100ng/ml)處理后,100ng/ml的TPA可以使B7-H4 m RNA表達(dá)上調(diào)較為明顯。100ng/ml的TPA分別作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞24、48、72小時(shí)后,流式分析結(jié)果顯示,HCT116細(xì)胞在作用48小時(shí)后B7-H4蛋白表達(dá)上調(diào)最為明顯,SW480細(xì)胞在作用72小時(shí)后B7-H4蛋白表達(dá)上調(diào)最為明顯。TPA作用48小時(shí)后,免疫熒光染色結(jié)果同樣顯示,TPA可促進(jìn)HCT116細(xì)胞B7-H4蛋白表達(dá)上調(diào);而PCR法及FCM檢測結(jié)果顯示,在PD98059作用后,HCT116細(xì)胞中B7-H4基因及蛋白表達(dá)下調(diào)�！窘Y(jié)論】結(jié)直腸癌組織中B7-H4存在基因及蛋白水平的上調(diào)表達(dá),提示結(jié)直腸癌組織中其表達(dá)可能受到了轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,PKC信號的活化可能參與了結(jié)直腸癌細(xì)胞B7-H4的表達(dá)調(diào)節(jié)。第二部分B7-H4及PKC-δ在結(jié)直腸癌中的表達(dá)相關(guān)性及其臨床意義【目的】檢測PKC-δ及B7-H4分子在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá),確定兩者的表達(dá)是否存在相關(guān)性,分析其表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系�！痉椒ā渴占�87例初診的結(jié)直腸癌標(biāo)本及15例癌旁組織,通過病理芯片、免疫組化染色技術(shù)、免疫熒光雙染等方法檢測B7-H4和PKC-δ在腫瘤組織的表達(dá)及其相關(guān)性,并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其臨床表達(dá)意義�！窘Y(jié)果】免疫組化結(jié)果顯示,在87例結(jié)直腸癌患者中,B7-H4表達(dá)陽性率為63.2%(55/87);PKC-δ表達(dá)陽性率為65.5%(57/87);其中結(jié)直腸癌細(xì)胞膜上存在PKC-δ明顯陽性表達(dá)的為40.2%(35/87)。B7-H4的異常表達(dá)與腫瘤浸潤深度有關(guān)(P0.05);PKC-δ的異常表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05);而PKC-δ的膜表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ducks臨床分期等多項(xiàng)臨床參數(shù)均有顯著差異(P0.05),更能反映結(jié)直腸癌的進(jìn)展。免疫組化及熒光雙染結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌組織上存在PKC-δ與B7-H4共表達(dá),且兩者表達(dá)具有顯著相關(guān)性(r=0.606,P0.01),其中膜表達(dá)PKC-δ的標(biāo)本有34例(34/35)存在B7-H4的強(qiáng)陽性表達(dá)�！窘Y(jié)論】本研究發(fā)現(xiàn)PKC-δ與B7-H4在結(jié)直腸癌細(xì)胞的表達(dá)顯著正相關(guān),且PKC-δ膜表達(dá)的增強(qiáng)與疾病惡性程度有顯著性意義;進(jìn)一步推測該酶活化的信號途徑可能參與調(diào)控了B7-H4的異常表達(dá),并參與了結(jié)直腸癌的病理進(jìn)程。第三部分結(jié)直腸癌細(xì)胞B7-H4異常表達(dá)的調(diào)控機(jī)制探討【目的】構(gòu)建并鑒定B7-H4 promoter/PGL3 Basic重組表達(dá)載體,篩選與B7-H4啟動(dòng)子特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,初步探討B(tài)7-H4在結(jié)直腸癌異常表達(dá)的調(diào)控機(jī)制�！痉椒ā空Ｈ巳蚪M文庫克隆得到B7-H4的啟動(dòng)子長片段。構(gòu)建B7-H4啟動(dòng)子不同片段的PGL3重組載體,分別將其轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細(xì)胞株或293T細(xì)胞,利用熒光素酶分析系統(tǒng)觀察其熒光強(qiáng)度的變化。將B7-H4 promoter/PGL3 Basic重組熒光表達(dá)載體轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細(xì)胞株,同時(shí)加入TPA處理后,利用熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)觀察其熒光強(qiáng)度的變化情況。根據(jù)該區(qū)域序列結(jié)合生物學(xué)分析軟件(http://genome.ucsc.edu/cgibin/hg Gateway)分析預(yù)測與B7-H4啟動(dòng)子區(qū)特異性結(jié)合的候選轉(zhuǎn)錄因子。同時(shí)通過染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)驗(yàn)證候選轉(zhuǎn)錄因子是否與B7-H4啟動(dòng)子特異區(qū)域相結(jié)合�！窘Y(jié)果】成功構(gòu)建了B7-H4 promoter/PGL3 Basic重組表達(dá)載體及不同截短型PGL3 Basic重組載體,分別將其轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細(xì)胞株HC T116后,熒光素酶檢測結(jié)果顯示,接近B7-H4開放閱讀框上游一段213bp的序列,即A-P1/PGL3 Basic重組表達(dá)載體具有較其它片段的PGL3 Basic重組載體更強(qiáng)的熒光表達(dá)(P0.05),為B7-H4啟動(dòng)子的核心區(qū)域;TPA處理各片段重組載體所轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染A-B長片段載體的細(xì)胞比轉(zhuǎn)染A-P1段載體的細(xì)胞具有更強(qiáng)的熒光表達(dá)(P0.05);生物學(xué)分析B7-H4啟動(dòng)子區(qū)序列后篩選得到兩個(gè)可能與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子FOXA1和STAG1,經(jīng)過Ch IP-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果表明FOXA1在LS-174T細(xì)胞中未與B7-H4啟動(dòng)子序列結(jié)合,而STAG1與該序列有一定的結(jié)合作用。【結(jié)論】本研究首先發(fā)現(xiàn)了B7-H4啟動(dòng)子的核心區(qū)域,進(jìn)一步熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn),TPA作用后轉(zhuǎn)染A-B片段載體的細(xì)胞比轉(zhuǎn)染A-P1段載體的細(xì)胞具有更高的熒光表達(dá),由此推測TPA可能促使了下游轉(zhuǎn)錄因子與B7-H4擴(kuò)展區(qū)啟動(dòng)子的結(jié)合,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞B7-H4上調(diào)表達(dá),STAG1可能參與了這一調(diào)節(jié)。綜上所述,本課題通過闡明B7-H4及PKC-δ在結(jié)直腸癌中的表達(dá)相關(guān)性及其臨床意義,初步探討了PKC信號對結(jié)直腸癌細(xì)胞B7-H4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制,為尋找有效的結(jié)直腸癌干預(yù)治療手段提供了新的理論并具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

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本文編號：1625756