本文選題：白血病細胞靶向　切入點：活體流式細胞儀　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景與目的白血病是一類嚴重危害人類健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤,主要以造血干細胞惡性增殖為特點,是兒童及青少年發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一。近年來,隨著人們對白血病生物學(xué)特性認識的不斷加深,對其相關(guān)的診斷和治療手段取得了顯著的提高。但是,由于白血病復(fù)發(fā)率較高,且復(fù)發(fā)后的白血病較初治患者而言,治療的難度大大增加,導(dǎo)致其長期無病生存率仍然較低。此外,由于白血病的常規(guī)治療方法目前仍然以化療為主,而化療藥物在緩解病情的同時往往對病人造成了不同程度的副反應(yīng),包括骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝腎損傷、免疫功能受損等。同時,白血病診斷的主要依據(jù)是骨髓或外周血中的細胞形態(tài)學(xué)檢查和細胞化學(xué)分析,包括:染色體核型分析、免疫學(xué)檢測(流式細胞術(shù))、熒光原位雜交技術(shù)和PCR技術(shù)等。然而,這些方法均不能實現(xiàn)對白血病細胞的直接檢測。鑒于當前白血病的診斷和治療方法中存在的問題和缺陷,急需發(fā)展一種針對白血病細胞具有特異性識別能力的靶向策略,用于白血病的靶向治療以及對白血病細胞動態(tài)監(jiān)測,尤其是對治療后微小殘留病灶的監(jiān)測。近年來,隨著腫瘤靶向診斷和治療策略研究的深入,針對白血病細胞的靶向策略正逐漸成為白血病研究中的新熱點,并得到了廣泛的關(guān)注。目前關(guān)于白血病治療的靶向策略主要包括:基于單克隆抗體、基因突變、表觀遺傳修飾和腫瘤相關(guān)調(diào)控的信號通路。然而,由于白血病細胞基因組本身的復(fù)雜性和惡性細胞異質(zhì)性,導(dǎo)致這些靶向策略只能針對特定類型的白血病細胞,影響了其臨床應(yīng)用前景。大量研究證實,缺氧微環(huán)境作為絕大多數(shù)實體腫瘤的基本特征之一,對腫瘤細胞基因不穩(wěn)定性、細胞代謝調(diào)控、腫瘤耐藥性、腫瘤血管生成以及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等均具有調(diào)控作用,是腫瘤靶向研究的重要策略。目前,關(guān)于腫瘤細胞缺氧的靶向策略主要是針對缺氧調(diào)控的細胞和缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α相關(guān)的信號調(diào)控通路。另外,線粒體作為細胞中功能最重要的細胞器之一,在不同生理和病理狀態(tài)下對細胞的生存和死亡調(diào)控都發(fā)揮著重要作用。在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),與正常細胞相比,白血病細胞的線粒體具有很多特殊性,包括:細胞內(nèi)數(shù)量更多,更加依賴于線粒體氧化磷酸化和脂肪酸氧化功能提供能量等。在本課題組的前期研究中,發(fā)現(xiàn)了一類具有近紅外熒光特性的七甲川花菁類小分子IR-780,其在體內(nèi)外實驗中被證實對多種人類腫瘤細胞均表現(xiàn)出良好的腫瘤選擇性,而且能夠特異性地蓄積于腫瘤細胞的線粒體中。然而,這類熒光小分子由于具有長共軛的強疏水性的七甲川鏈,導(dǎo)致其在水溶液中容易聚集,影響其對血液中腫瘤細胞的靶向特性。為了進一步提高該類熒光小分子的生物相容性和臨床應(yīng)用潛能,我們通過在IR-780的N-烷基側(cè)鏈上進行水溶性氨基酸基團修飾的方法,成功地合成了一類新型的七甲川花菁類熒光小分子,并研究其對血液腫瘤細胞和循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)的靶向作用,初步探索了其對白血病細胞的可能的靶向作用機制,為白血病的診斷和治療提供了新的靶向策略,同時對進一步揭示白血病生物學(xué)特性和循環(huán)腫瘤細胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的意義,提供了新的參考。主要研究方法與結(jié)果,包括以下四部分:1.甘氨酸修飾的IR-780衍生物NIR-26和NIR-27的合成、鑒定及生物學(xué)活性的研究。通過在IR-780的N-烷基側(cè)鏈上進行水溶性氨基酸基團修飾的方法,合成了一類新型七甲川花菁類熒光小分子NIR-26和NIR-27,并對其結(jié)構(gòu)進行了鑒定;同時評價了NIR-26和NIR-27的光學(xué)特性和水溶性。進一步研究了NIR-26、NIR-27在小鼠體內(nèi)的分布和代謝情況,及其對大鼠的急性毒性。主要的研究結(jié)果如下:1.1通過在IR-780的N-烷基側(cè)鏈上進行水溶性氨基酸基團修飾的方法,分別獲得化合物NIR-26和NIR-27,其不但保留了IR-780和ICG的近紅外特性,還顯著提高了IR-780類似物的水溶性。其中,NIR-26的水溶性比IR-780提高了至少20000倍。這說明在化合物結(jié)構(gòu)中引入氨基酸或氨基酸酯基團等結(jié)構(gòu)修飾,可獲得具有較好水溶性的新型七甲川花菁類熒光小分子。1.2通過測試NIR-26和NIR-27在甲醇、PBS和血清(100%FBS)三種溶劑中的吸收和發(fā)射光譜圖可知,NIR-26和NIR-27保留了IR-780熒光特性且均位于近紅外光譜范圍,其在血清中的穩(wěn)定性較好。同時發(fā)現(xiàn)NIR-26的水溶性較IR-780得到了很大改善,且熒光強度明顯高于ICG和NIR-27,說明NIR-26具有成為生物體內(nèi)標記和活體顯影的近紅外熒光探針的潛力。1.3通過NIR-26和NIR-27在正常小鼠體內(nèi)的分布及代謝實驗可知,該類熒光小分子的代謝途徑可能是經(jīng)靜脈注射后,全身分布并隨血循環(huán)快速分布于肝臟、腎臟等代謝臟器。進一步根據(jù)小鼠24 h的糞便中存在較強的熒光信號可知,該類熒光小分子有可能是由肝臟通過膽汁分泌排出體外。1.4通過NIR-26和NIR-27的大鼠急性毒性實驗,發(fā)現(xiàn)注射100倍標記劑量的NIR-26和NIR-27后,SD大鼠的一般狀況良好、體重無明顯減輕,血、生化指標未見異常改變,進一步觀察大鼠各組織器官切片均未發(fā)現(xiàn)明顯的異常改變,說明該類小分子在本實驗條件下對大鼠無明顯急性毒性作用。2.分別建立白血病細胞的裸鼠荷瘤模型和人白血病細胞小鼠模型,研究七甲川花菁類熒光小分子NIR-26對白血病細胞的靶向特性,并將雙通道活體流式細胞儀應(yīng)用于研究NIR-26對白血病細胞的靶向特性。主要的研究結(jié)果如下:2.1在GFP標記的HL-60細胞裸鼠皮下荷瘤模型上,證明了NIR-26對白血病細胞具有明顯的靶向性和近紅外成像特性,并且能夠與GFP熒光共定位于腫瘤組織中。進一步對模型小鼠的主要臟器和腫瘤組織進行離體成像,顯示腫瘤組織的NIR熒光信號強度明顯高于其它器官,且NIR與GFP熒光能夠很好的共定位于腫瘤組織。通過激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤組織冰凍切片,發(fā)現(xiàn)了NIR與GFP熒光能夠很好的共定位。在Jurkat和K562細胞建立的裸鼠皮下荷瘤模型上,同樣驗證了NIR-26的腫瘤靶向作用和近紅外成像特性。2.2通過對60Coγ射線全身照射后的C57BL/6小鼠尾靜脈注射GFP標記的HL-60細胞的方法,建立了人白血病細胞小鼠模型,并使用活體流式細胞儀對該模型小鼠外周血中的HL-60細胞進行實時動態(tài)監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)HL-60細胞能夠較長時間的存在于小鼠循環(huán)系統(tǒng)內(nèi),且其數(shù)量在一定范圍內(nèi)發(fā)生波動。進一步對模型小鼠的各重要臟器和外周血進行觀察,發(fā)現(xiàn)白血病細胞主要存在于骨髓,且在外周血中有一定的分布,同時在脾臟和肝臟等器官中也有不同程度的細胞浸潤,證明了該種方法可以建立全身擴散的人急性骨髓性白血病細胞小鼠模型。2.3首次成功建立并使用雙通道(488 nm和785 nm)的活體流式細胞儀,對白血病模型小鼠外周血中的兩種熒光信號同時進行監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)在尾靜脈注射NIR-26后的第10天,NIR熒光細胞的信號峰與GFP熒光細胞的信號峰重合情況較好,且雙標細胞的數(shù)量達到GFP熒光細胞總數(shù)的89.74%,說明NIR-26在注射之后的第10天對循環(huán)系統(tǒng)中的HL-60細胞有明顯的靶向作用。進一步將從模型小鼠外周血提取的PBMCs細胞涂片、股骨和脾臟的冰凍切片分別置于激光共聚焦顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)NIR與GFP熒光共定位較好,證明了NIR-26對小鼠體內(nèi)的人白血病細胞具有靶向作用和近紅外成像特性。3.研究了七甲川花菁類熒光小分子NIR-26對白血病細胞的體外靶向作用,并初步探索了其可能的靶向作用機制。主要的研究結(jié)果如下:3.1以不同濃度和不同時長的標記條件,用NIR-26分別對PBMCs和HL-60細胞進行標記,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)在5μM,20 min的標記條件下,HL-60細胞的熒光信號顯著高于正常人的PBMCs細胞,進一步在其它兩種白血病細胞Jurkat和K562中進行驗證,同樣發(fā)現(xiàn)PBMCs與Jurkat和K562細胞的熒光信號強度有顯著性差異。選定該標記條件作為NIR-26體外標記細胞的最適條件。3.2將GFP標記的HL-60細胞和正常人的PBMCs按照約1:1的比例混合,模擬臨床白血病患者的外周血情況,然后用NIR-26(5μM,20 min)進行標記,發(fā)現(xiàn)NIR-26能夠特異性地識別混合在PBMCs中具有GFP熒光的HL-60細胞,表明NIR-26能夠特異性地識別外周血中的白血病細胞。3.3分離提取了白血病患者和健康志愿者的單個核細胞,用NIR-26(5μM,20 min)標記并細胞涂片后,觀察發(fā)現(xiàn)與健康志愿者比較,NIR-26能夠識別白血病患者單個核細胞中的一群異常細胞,熒光信號強度明顯高于其它細胞,說明NIR-26能夠特異性地識別臨床白血病患者外周血中的白血病細胞。3.4在機制研究中,觀察發(fā)現(xiàn)NIR-26通過依賴能量的主動轉(zhuǎn)運方式進入白血病細胞。使用缺氧培養(yǎng)條件和OATPs轉(zhuǎn)運體抑制劑BSP分別處理白血病細胞后,發(fā)現(xiàn)缺氧條件能夠促進NIR-26進入白血病細胞,而BSP顯著抑制了NIR-26進入白血病細胞。進一步分別通過缺氧誘導(dǎo)劑氯化鈷(Co Cl2)上調(diào)HIF-1α和si RNA抑制HIF-1α的表達,觀察到NIR-26進入細胞的量與細胞HIF-1α水平呈正相關(guān),同時HIF-1α直接影響細胞中OATPs轉(zhuǎn)運體的表達水平,揭示了缺氧依賴性HIF-1α/OATPs信號通路參與NIR-26進入白血病細胞的機制。4.進一步研究了NIR-26對實體瘤和循環(huán)腫瘤細胞的靶向近紅外成像特性,及NIR-26對臨床晚期肺癌患者外周血中CTCs的檢測情況,主要的研究結(jié)果如下:4.1在GFP標記的A549細胞裸鼠荷瘤模型上,NIR-26具有明顯的腫瘤靶向和近紅外成像特性,并且能夠與GFP熒光的腫瘤組織共定位。進一步對模型小鼠的主要臟器和腫瘤組織進行離體成像,顯示腫瘤組織的NIR熒光信號強度明顯高于其它器官,且NIR與GFP熒光能夠共定位于腫瘤組織中。通過激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤組織冰凍切片,發(fā)現(xiàn)了NIR與GFP熒光能夠很好的共定位。在MKN-45和U251細胞的裸鼠皮下荷瘤模型上,同樣驗證了NIR-26對腫瘤細胞靶向作用和近紅外成像特性。4.2將GFP標記的A549細胞和正常人的PBMCs按照約1:1的比例混合,模擬臨床轉(zhuǎn)移性腫瘤患者的外周血情況,然后用NIR-26(5μM,20 min)進行標記發(fā)現(xiàn),NIR-26能夠靶向混合在PBMCs中具有GFP熒光的A549細胞,表明NIR-26能夠特異性地識別外周血中的循環(huán)腫瘤細胞CTCs,并可通過其近紅外熒光示蹤CTCs。4.3用NIR-26(5μM,20 min)分別標記晚期肺癌骨轉(zhuǎn)移患者和正常人的PBMCs后,通過細胞免疫熒光染色的方法檢測外周血中表達Ep CAM的CTCs,在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),NIR-26能夠靶向PBMCs中Ep CAM陽性的CTCs,且NIR與GFP熒光共定位較好,表明NIR-26能夠靶向臨床晚期轉(zhuǎn)移性腫瘤患者外周血中的CTCs。結(jié)論:在課題組前期研究工作的基礎(chǔ)上,本文通過在IR-780的N-烷基側(cè)鏈上進行水溶性氨基酸基團修飾的方法,成功地合成一類具有近紅外熒光特性,良好的水溶性和生物相容性的新型七甲川花菁類熒光小分子,并將其應(yīng)用于血液腫瘤細胞和循環(huán)腫瘤細胞的靶向識別研究。通過體內(nèi)外實驗,證實了七甲川花菁類熒光小分子NIR-26對白血病細胞的靶向作用,同時發(fā)現(xiàn)其選擇性地蓄積于白血病細胞的線粒體中。建立了人白血病細胞小鼠模型,成功建立并應(yīng)用雙通道活體流式細胞儀實現(xiàn)了在體條件下對其血液中的腫瘤細胞的實時動態(tài)監(jiān)測,對白血病的早期診斷,抗白血病藥物的篩選、療效及預(yù)后的評價均有重要意義。此外,NIR-26對臨床晚期腫瘤患者外周血中循環(huán)腫瘤細胞CTCs同樣具有特異性的靶向作用,為進一步發(fā)展基于此類熒光探針用于循環(huán)腫瘤細胞的靶向性檢測提供了依據(jù)和基礎(chǔ)。進一步探索了NIR-26對白血病細胞的靶向作用機制,揭示其缺氧依賴性HIF-1α/OATPs信號通路介導(dǎo)NIR-26進入白血病細胞。鑒于缺氧是腫瘤細胞內(nèi)在的生物學(xué)特性,所以通過缺氧依賴性的細胞攝取機制使得NIR-26對靶向異質(zhì)性腫瘤細胞具有普遍意義,進一步的機制研究為白血病的靶向治療策略提供了新的參考和依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7

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本文編號：1620166