本文選題：膠質(zhì)瘤　切入點(diǎn)：腫瘤血管生成　出處：《蘇州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分膠質(zhì)瘤細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外融合實(shí)驗(yàn)背景與目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)因具有自我更新、多向分化的潛力,一直受到學(xué)者們的關(guān)注。最近發(fā)現(xiàn)BMSCs可以被招募到膠質(zhì)瘤微環(huán)境中,通過(guò)直接或間接作用對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要作用。但膠質(zhì)瘤細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否可以通過(guò)細(xì)胞融合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)尚不明確。本部分?jǐn)M研究體外共培養(yǎng)體系中的膠質(zhì)瘤細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察兩者是否可以發(fā)生體外融合,及融合后細(xì)胞的生物學(xué)變化。方法:構(gòu)建表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞SU3-RFP,同時(shí)獲取轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)基因裸小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs,將SU3-RFP與BMSCs體外共培養(yǎng),熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察,用流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選出RFP+/GFP+細(xì)胞,對(duì)其進(jìn)行分子標(biāo)記物的鑒定,CCK-8法、軟瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等分析融合細(xì)胞的增殖、遷移能力,皮下致瘤實(shí)驗(yàn)比較融合細(xì)胞和親本膠質(zhì)瘤細(xì)胞的致瘤能力。結(jié)果:獲取的BMSCs穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白,高表達(dá)CD105、CD90、CD44,基本不表達(dá)CD45、CD11b,并具有成骨、成脂肪分化能力。SU3-RFP和BMSCs共培養(yǎng)后在熒光顯微鏡下觀察到RFP+/GFP+細(xì)胞,經(jīng)活細(xì)胞工作站可以觀測(cè)到細(xì)胞融合的過(guò)程。單克隆RFP+/GFP+細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定其表達(dá)RFP、GFP、CD105、Nestin。體外生物學(xué)研究顯示融合細(xì)胞增殖速度快于SU3-RFP,克隆形成能力及遷移能力強(qiáng)于SU3-RFP。將融合細(xì)胞及SU3-RFP接種BALB/C裸鼠皮下,均致瘤(5/5),融合細(xì)胞移植瘤體積為779.6±177.78 mm2,重量為0.62±0.14g;SU3-RFP移植瘤的體積為414.01±105.04mm2,重量為0.33±0.08g。結(jié)論:膠質(zhì)瘤細(xì)胞SU3-RFP能與BMSCs在體外發(fā)生自發(fā)融合,融合細(xì)胞同時(shí)表達(dá)親本細(xì)胞的特征性基因和蛋白,且與親本膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比惡性度更高。第二部分融合細(xì)胞體內(nèi)、體外成血管實(shí)驗(yàn)研究背景與目的:腫瘤血管生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)至關(guān)重要,膠質(zhì)瘤內(nèi)豐富的血供、活躍的血管新生也是膠質(zhì)瘤惡性表現(xiàn)之一。本部分?jǐn)M通過(guò)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究融合細(xì)胞是否具有成血管能力,并通過(guò)檢測(cè)融合細(xì)胞與親本膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干性基因表達(dá)差異,探尋可能的機(jī)制。方法:將三組細(xì)胞培養(yǎng)于Matrigel上,動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化。同時(shí)將三組細(xì)胞培養(yǎng)于內(nèi)皮細(xì)胞分化培養(yǎng)基內(nèi),并以培養(yǎng)在普通條件下的三組細(xì)胞作為對(duì)照,24小時(shí)后,通過(guò)RT-PCR、Western Blot、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31、CD34、VE-Cadherin的表達(dá)。通過(guò)SU3-RFP及融合細(xì)胞裸鼠顱內(nèi)原位致瘤,比較移植瘤的微血管密度,檢測(cè)體內(nèi)血管生成能力。用流式細(xì)胞術(shù)分析融合細(xì)胞和SU3-RFP細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的比例,用RT-PCR檢測(cè)干性基因Nanog、Oct-4、Sox2的表達(dá),驗(yàn)證三株細(xì)胞的干性基因表達(dá)差異。結(jié)果:培養(yǎng)在Matrigel上的融合細(xì)胞逐漸形成管狀結(jié)構(gòu),在內(nèi)皮分化條件刺激下,多種血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志分子(CD31、CD 34、VE-Cadherin)在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平顯著上調(diào)。融合細(xì)胞和SU3-RFP裸小鼠原位移植均具有致瘤性,CD31免疫組織化學(xué)染色計(jì)算微血管密度(MVD),在融合細(xì)胞移植瘤為19.67±1.8/視野,SU3-RFP移植瘤為7.16±0.54/視野,融合細(xì)胞組明顯高于SU3-RFP組。檢測(cè)融合細(xì)胞和親代膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性標(biāo)記物表達(dá)發(fā)現(xiàn),融合細(xì)胞中CD133+細(xì)胞比例、Nanog、Oct-4、Sox2表達(dá)水平均高于SU3-RFP。結(jié)論:融合細(xì)胞與親本膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比,體內(nèi)、體外成血管能力均增強(qiáng),可能與細(xì)胞融合后干性基因表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。第三部分利用雙色熒光示蹤裸小鼠移植瘤模型研究膠質(zhì)瘤血管生成中的細(xì)胞融合作用背景與目的:研究體內(nèi)腫瘤血管生成過(guò)程需要良好的示蹤模型,以顯示腫瘤細(xì)胞和宿主的相關(guān)作用關(guān)系。本部分?jǐn)M采用雙色熒光示蹤的腫瘤模型,分析移植瘤中的血管結(jié)構(gòu),尋找融合細(xì)胞參與腫瘤血管生成的證據(jù)。方法:將膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SU3-RFP細(xì)胞,接種于表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的NC-C57Bl/6J-GFP裸鼠右側(cè)尾狀核,接種后4周,一部分移植瘤做切片觀察,一部分做原代培養(yǎng)。部分移植瘤組織采用厚切片壓片法觀察,部分移植瘤組織用OCT包埋后做5μm連續(xù)冰凍切片在熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察。荷瘤鼠無(wú)菌條件下完整取出腫瘤,消化后獲取原代細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RFP+細(xì)胞、GFP+細(xì)胞、RFP+/GFP+細(xì)胞所占的比例。結(jié)果:熒光顯微鏡下可以區(qū)分表達(dá)RFP的腫瘤細(xì)胞和表達(dá)GFP的宿主細(xì)胞。組織壓片在熒光顯微鏡下觀察到共表達(dá)RFP和GFP的管腔樣結(jié)構(gòu),提示存在腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞融合產(chǎn)生的黃色血管。激光共聚焦顯微鏡下觀察腫瘤組織冰凍切片,發(fā)現(xiàn)血管壁上存在RFP+/GFP+細(xì)胞,因相鄰切片的相鄰位置細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD105、CD90,我們推測(cè)這些RFP+/GFP+/CD105+/CD90+細(xì)胞由腫瘤細(xì)胞和宿主骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞融合而來(lái)。結(jié)論:雙色熒光蛋白示蹤的可移植性膠質(zhì)瘤模型,可清晰顯示腫瘤組織中的宿主血管、腫瘤血管和腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞共建的血管,從而證實(shí)了細(xì)胞融合是腫瘤血管生成的重要途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：1618812