發(fā)布時(shí)間：2018-03-15 21:47

  本文選題：側(cè)群細(xì)胞　切入點(diǎn)：腫瘤干細(xì)胞　出處：《鄭州大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在過去20~30年間,全球范圍內(nèi)肺癌的發(fā)病率和死亡率一直呈現(xiàn)逐步上升的態(tài)勢(shì),肺癌也已經(jīng)成為臨床最常見的癌癥致死因素,根據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新調(diào)查報(bào)告,在世界范圍內(nèi)肺癌的發(fā)病率高居惡性腫瘤的第一位。肺癌按照病理類型劃分,可以分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC又可細(xì)分為若干種病理類型,最常見的包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌等,NSCLC的發(fā)病率占肺癌總發(fā)病率的80%以上。肺癌整體惡性程度較高,現(xiàn)有治療效果欠佳,無論原發(fā)灶的大小,肺癌患者常出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移,并且治療后復(fù)發(fā)率很高。目前肺癌的治療方法包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)藥物治療、免疫治療和靶向治療等。盡管眾多治療手段已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床,但肺癌的治療效果仍然不盡理想,總體五年生存率低于15%。近年來腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)學(xué)說越來越被學(xué)者們所接受,該理論認(rèn)為,CSCs雖然在數(shù)量上只占腫瘤細(xì)胞總數(shù)很少的比例,但是這些細(xì)胞具有無限增殖、自我更新以及多向分化的能力。它們?cè)谀[瘤的發(fā)生、生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的過程中起到了決定性作用,并且對(duì)放化療有較強(qiáng)的抵抗性,也是腫瘤治療失敗的主要原因。側(cè)群(Side Population,SP)細(xì)胞是一類可將熒光染料Hoechst33342泵出細(xì)胞外,在熒光免疫分選時(shí)顯現(xiàn)弱熒光信號(hào)的細(xì)胞群。有研究表明,這一類SP細(xì)胞能夠高表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2/BCRPI,該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位于腫瘤細(xì)胞膜,能夠?qū)⒑芏嗉?xì)胞毒性化療藥物泵出細(xì)胞外,減輕化療藥物對(duì)其造成的傷害,產(chǎn)生耐藥性。同時(shí)SP細(xì)胞大多表達(dá)有相應(yīng)CSCs的標(biāo)記分子,具有極強(qiáng)的致瘤能力,研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)于放射線的耐受性也較非SP細(xì)胞更強(qiáng)。目前在很多腫瘤細(xì)胞系中都已經(jīng)檢測(cè)到了SP細(xì)胞亞群的存在,這一類細(xì)胞具有明顯的CSCs生物學(xué)特性,所以在缺乏顯著干細(xì)胞分子標(biāo)記的情況下,SP細(xì)胞亞群越來越被多地被當(dāng)做CSCs來進(jìn)行研究。近年來,SP細(xì)胞分析法已經(jīng)廣泛用于從腫瘤細(xì)胞系和原代細(xì)胞中分選、鑒定干細(xì)胞樣細(xì)胞。在不同的實(shí)驗(yàn)室的癌細(xì)胞已傳代出很多NSCLC細(xì)胞系,但是有研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室從相同NSCLC細(xì)胞系中分離SP細(xì)胞的比例卻呈現(xiàn)很大的差異。還有證據(jù)表明,反復(fù)傳代細(xì)胞系常常導(dǎo)致其特性的改變。因此,有理由懷疑不同實(shí)驗(yàn)室采用的NSCLC細(xì)胞系可能是由于傳代數(shù)不同造成了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。所以長期傳代對(duì)于NSCLC細(xì)胞中的SP細(xì)胞生物學(xué)特性和功能特性的影響具有很高的研究?jī)r(jià)值。本研究將人肺腺癌A549細(xì)胞系和術(shù)中采集的NSCLC細(xì)胞分別進(jìn)行傳代培養(yǎng),利用基于ABCG2介導(dǎo)的Hoechst 33342染料排斥原理,采用流式細(xì)胞技術(shù),分選出早期傳代和后期傳代細(xì)胞系中的SP細(xì)胞。進(jìn)一步研究增加細(xì)胞傳代數(shù)是否可以改變SP細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)特性和功能特性,這可能有助于解釋當(dāng)前有爭(zhēng)議的研究結(jié)果和更好地了解NSCLC干細(xì)胞的生物學(xué)特性。第一部分早期/后期傳代的原代NSCLC細(xì)胞株和A549細(xì)胞系中SP細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定研究方法1.A549細(xì)胞系和NSCLC原代細(xì)胞經(jīng)過不同的傳代數(shù)(2代和50代)后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞系中是否存在SP細(xì)胞,以及對(duì)SP細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選。2.在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過程中,維拉帕米具有顯著降低SP細(xì)胞分?jǐn)?shù)的特性,利用此種特性鑒定SP細(xì)胞。結(jié)果1.在A549細(xì)胞系和原代NSCLC細(xì)胞的各代細(xì)胞中均含有類似SP細(xì)胞的細(xì)胞亞群。分離早期傳代(第2代)和后期傳代(第50代)細(xì)胞系的A549和原代NSCLC細(xì)胞株SP細(xì)胞成分。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè),結(jié)果顯示,早期和后期傳代的A549細(xì)胞系,SP細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例分別為2.78%和2.03%,早期和后期傳代的原代NSCLC細(xì)胞株,SP細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例則分別5.81%和4.93%。2.在維拉帕米的作用下,4組細(xì)胞的SP細(xì)胞分?jǐn)?shù)均顯著降低。結(jié)論1.成功分離鑒定了A549細(xì)胞系和原代NSCLC細(xì)胞株的早期和后期傳代SP細(xì)胞亞群。2.原代NSCLC細(xì)胞株和A549細(xì)胞系經(jīng)長期傳代后,SP細(xì)胞分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。第二部分早期/后期傳代的原代NSCLC細(xì)胞株和A549細(xì)胞系中SP細(xì)胞的生物學(xué)特性的比較研究研究方法1.克隆形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)早期/后期傳代的原代NSCLC細(xì)胞和A549細(xì)胞系中SP細(xì)胞(共4組)增殖能力的差異。2.細(xì)胞成球形實(shí)驗(yàn),檢測(cè)4組SP細(xì)胞自我更新能力的差異。3.NOD/SCID小鼠皮下接種成瘤實(shí)驗(yàn),在NOD/SCID小鼠皮下分別移植不同數(shù)量級(jí)的SP細(xì)胞,評(píng)估4組SP細(xì)胞致瘤能力差異。4.對(duì)4組SP細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。5.腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)基因的檢測(cè),CSCs的遷移和侵襲能力均經(jīng)常與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)聯(lián)。因此,對(duì)EMT相關(guān)基因如E-cadherin、N-cadherin、Snail和Twist的表達(dá)也進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果1.早期和后期傳代A549細(xì)胞系SP細(xì)胞克隆形成效率分別為79.81±5.71%和66.84±3.47%(P0.05)。早期和后期傳代的原代NSCLC細(xì)胞株SP細(xì)胞平均集落形成百分率分別為78.27±2.26%和61.45±3.72%(P0.05)。2.A549細(xì)胞系第2和第50代SP細(xì)胞成球率分別為15.70±2.42%、9.45±0.68%(P0.05);原代NSCLC細(xì)胞株上述兩值分別為12.46±1.63%、8.08±1.50%(P0.05)。3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,早期和后期傳代的A549細(xì)胞系中SP細(xì)胞分別需要1×104個(gè)和1×105個(gè)可以成瘤(均為2/3),早期和后期傳代的原代NSCLC細(xì)胞株中SP細(xì)胞分別需要1×102個(gè)和1×104個(gè)可以成瘤(均為1/3)。兩種來源的肺癌細(xì)胞,在經(jīng)過長期傳代后,其SP細(xì)胞的致瘤率均有明顯下降。4.實(shí)時(shí)熒光PCR分析表明,兩種細(xì)胞系第2代與第50代SP細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因的m RNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(除在A549細(xì)胞中Bmi-1表達(dá)以外)。5.實(shí)時(shí)PCR分析表明,在4組SP細(xì)胞中,N-cadherin、Snail和Twist的基因表達(dá),第2代SP細(xì)胞均高于第50代SP細(xì)胞(P0.05)。對(duì)于E-cadherin的表達(dá),在A549細(xì)胞系第50代的SP細(xì)胞高于第2代(P0.05),而在原代NSCLC細(xì)胞株,早期/后期傳代SP細(xì)胞則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。結(jié)論1.經(jīng)過長期傳代的兩種NSCLC細(xì)胞中的SP細(xì)胞,其CSCs的功能特性(如致瘤能力、自我更新能力、遷移和侵襲能力等)均明顯減弱。2.原代腫瘤細(xì)胞和早期傳代細(xì)胞系的SP細(xì)胞可能是CSCs研究的更好材料。第三部分早期/后期傳代的原代NSCLC細(xì)胞株和A549細(xì)胞系中SP細(xì)胞的放化療抵抗性差異研究研究方法1.不同傳代數(shù)的細(xì)胞系中SP細(xì)胞對(duì)于放射線的反應(yīng)情況進(jìn)行比較,采用單擊多靶模型計(jì)算分析各組SP細(xì)胞的N、D0、Dq、SER值,分析其放射敏感性的變化情況。2.不同傳代數(shù)的細(xì)胞系SP細(xì)胞對(duì)于化療藥物多柔比星的反應(yīng)性檢測(cè)比較,分析其化療藥物敏感性的變化情況。3.放化療誘導(dǎo)的SP細(xì)胞凋亡率檢測(cè)比較,對(duì)于多柔比星和電離輻射誘導(dǎo)的早期和后期傳代SP細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。分別用2Gy放射線照射、500nmol/L的多柔比星的溫育作為預(yù)處理手段,再檢測(cè)各組SP細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。結(jié)果1.無論是A549細(xì)胞系(照射劑量8Gy)還是原代NSCLC細(xì)胞株(照射劑量6~8Gy),其第2代SP細(xì)胞均比第50代SP細(xì)胞表現(xiàn)出更高的放射抗拒性。經(jīng)過2Gy照射后,A549細(xì)胞系第2代和第50代細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)分別為55.84%±1.91%、50.26%±2.24%(P0.05);NSCLC細(xì)胞株第2代和第50代細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)分別為70.32±1.52%、58.13%±1.21%(P0.05)。上述放射生物學(xué)參數(shù)顯示第2代比第50代的SP細(xì)胞顯示出更高的輻射耐受性。第2代細(xì)胞的Dq值均顯著大于第50代細(xì)胞,這表明的SP細(xì)胞的亞致死性損傷修復(fù)能力隨著傳代數(shù)的增加在減弱。2.SRB測(cè)定表明,A549細(xì)胞第2代SP細(xì)胞相對(duì)于第50代SP細(xì)胞明顯更加抗拒高劑量的多柔比星(1000 n M)(P0.05);對(duì)于低劑量多柔比星的反應(yīng)性則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。原代NSCLC細(xì)胞株,第2代SP細(xì)胞相比第50代SP細(xì)胞顯示出更大的高劑量多柔比星(1000 n M)抵抗性(P0.05);而在低劑量多柔比星作用下,其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.經(jīng)過2Gy電離輻射照射后,早期和后期傳代A549細(xì)胞系SP細(xì)胞凋亡率分別為7.94±0.82%和10.32±1.13%(P0.05)。經(jīng)過500n M的多柔比星的預(yù)溫育后,在第2代和第50代細(xì)胞凋亡率分別為22.76±2.81%和27.95±3.17%(P0.05)。在早期和后期傳代NSCLC細(xì)胞株中也觀察到類似的結(jié)果,后期傳代SP細(xì)胞的凋亡率高于早期傳代的SP細(xì)胞(P0.05)。結(jié)論1.不同傳代數(shù)NSCLC細(xì)胞的SP細(xì)胞成分顯示了不同的多柔比星和放射線敏感性。2.兩種來源的NSCLC細(xì)胞經(jīng)過長期傳代后SP細(xì)胞的放化療抵抗性均明顯下降。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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6 張騰飛;吉西他濱與AMD3100聯(lián)合應(yīng)用于膽管癌RBE細(xì)胞株對(duì)CXCR4/CXCL12軸的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

7 王們X ;EAAL細(xì)胞聯(lián)合全反式維甲酸對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549體內(nèi)外作用的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

8 李超楠;兩種典型OPFRs對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性及其機(jī)制探究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

9 楊明;促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子1型受體經(jīng)cAMP/PKA信號(hào)通路對(duì)U87MG細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

10 李廣康;RNAi沉默Rap2B基因?qū)盒赞D(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞的作用[D];鄭州大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1616947