本文選題：重組新城疫病毒　切入點(diǎn)：白介素-29　出處：《江蘇大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:IL-29具有抗腫瘤和抗增殖的作用。最近有研究表明表達(dá)IL-29的重組新城疫病毒(Recombinant Newcastle Disease Virus expressing IL-29,r L-29)能引起胃癌細(xì)胞凋亡。也有學(xué)者指出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)能誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的自噬和凋亡。在本研究中,我們探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與r L-29引起人肺腺癌細(xì)胞A549凋亡的關(guān)系及其潛在的機(jī)制。方法:1.病毒感染細(xì)胞的鑒定運(yùn)用Western Blot檢測A549、SK-MES-1和Lewis細(xì)胞株IL-28R蛋白的表達(dá)水平;通過ELISA、PCR、免疫熒光檢測病毒感染細(xì)胞后IL-29蛋白的表達(dá)。2.r L-29對A549細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響將不同MOI的r L-29、NDV感染A549細(xì)胞,MTT檢驗(yàn)其抑制率;通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測A549細(xì)胞的克隆形成率;運(yùn)用劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell檢驗(yàn)細(xì)胞的遷移。3.r L-29對A549細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)蛋白的影響運(yùn)用Western Blot檢驗(yàn)r L-29感染A549后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、CHOP、p-e IF2α的水平;免疫熒光觀察GRP78、CHOP的表達(dá);通過Western Blot檢測凋亡蛋白cleaved caspase3、cleaved caspase8、cleaved caspase9、BCL-2/Bax的表達(dá)情況。4.阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對r L-29感染的A549細(xì)胞發(fā)生自噬與凋亡的影響在r L-29處理A549前給予4PBA、si CHOP、si PERK進(jìn)行干預(yù),采用Western Blot分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬、凋亡蛋白的水平。5.阻斷JNK信號通路對r L-29感染的A549細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡的影響以JNK抑制劑作用A549細(xì)胞后,MOI為10的r L-29、NDV病毒感染A549細(xì)胞24 h,采用Western Blot檢測p-JNK、LC3II、cleaved caspase3的表達(dá)水平。6.干擾BCL-2后對r L-29引起的自噬及凋亡的影響通過FAM-si RNA BCL-2作用細(xì)胞,免疫熒光觀察si RNA BCL-2轉(zhuǎn)染效率;采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆情況;通過si BCL-2轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,運(yùn)用Western Blot分析A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白(LC3、beclin1)、凋亡相關(guān)蛋白(cleaved caspase3)的表達(dá)量。7.r L-29在體內(nèi)抑制A549細(xì)胞生長及部分機(jī)制本研究首先構(gòu)建A549裸鼠腫瘤模型,并利用r L-29、NDV病毒液和等量PBS于裸鼠瘤體注射,定期測量裸鼠瘤體的大小,采用Western Blot觀察其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、CHOP、p-e IF2α,自噬相關(guān)蛋白beclin1、LC3II,凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase3、BCL-2/bax的表達(dá)。結(jié)果:1.Western Blot發(fā)現(xiàn)IL-28R蛋白的表達(dá)在A549細(xì)胞株明顯上升。與NDV組及對照組相比,ELISA、PCR、免疫熒光顯示IL-29在r L-29組表達(dá)較高。2.MOI為10的r L-29和NDV病毒感染A549后,A549生長明顯被抑制;r L-29組A549細(xì)胞的增殖及遷移能力較差。3.r L-29感染A549細(xì)胞后,Western Blot顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、p-e IF2α,凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase3、cleaved caspase8、cleaved caspase9表達(dá)明顯增加,BCL-2/Bax表達(dá)明顯下降。免疫熒光顯示r L-29組GRP78、CHOP的表達(dá)量上調(diào)。4.4PBA、si CHOP、si PERK處理后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬、凋亡蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)。5.JNK抑制劑處理后,Western Blot顯示p-JNK、cleaved caspase3、LC3II水平顯著降低。6.si RNA BCL-2轉(zhuǎn)染成功;si BCL-2處理A549細(xì)胞后,A549細(xì)胞克隆形成率降低;Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除BCL-2后,LC3、beclin1、cleaved caspase3水平升高。7.A549裸鼠腫瘤模型成功建立;r L-29、NDV病毒液和等量PBS于裸鼠瘤體注射后,r L-29組瘤體體積較NDV組和對照組小;Western Blot發(fā)現(xiàn)r L-29組GRP78、CHOP、p-e IF2α、beclin1、LC3II、cleaved caspase3的表達(dá)水平顯著上調(diào),BCL-2/Bax表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過r L-29處理A549細(xì)胞及腫瘤組織,證實(shí)了r L-29抑制了A549細(xì)胞的生長增殖和遷移能力,并在A549細(xì)胞及腫瘤組織中誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬、凋亡。且證實(shí)了r L-29可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中PERK-e IF2α途徑和IRE1/JNK/BCL-2途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生自噬、凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1611292