本文選題：EBV相關(guān)淋巴瘤　切入點(diǎn)：表達(dá)譜芯片　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分EBV mi RNA在EBV相關(guān)淋巴瘤中的生物信息學(xué)分析目的挖掘Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫中潛在的與EBV相關(guān)淋巴瘤有關(guān)的EBV mi RNA及其靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證。方法在GEO數(shù)據(jù)庫中根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)篩選并下載EBV相關(guān)淋巴瘤的mi RNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE52916和m RNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE38885,運(yùn)用GEO2R在線分析工具進(jìn)行差異表達(dá)EBV mi RNA和m RNA篩選,利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件工具進(jìn)行生物學(xué)功能注釋、通路富集、EBV mi RNA-m RNA互作分析,對(duì)EBV mi RNA在EBV相關(guān)淋巴瘤中的作用進(jìn)行綜合評(píng)估。最后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)篩選得到的EBV mi RNA在EBV陽性細(xì)胞Raji、Daudi、Farage和EBV陰性細(xì)胞Ramos、Pfeiffer中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果在GEO數(shù)據(jù)庫中獲得了符合納入標(biāo)準(zhǔn)的mi RNA和m RNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集各一組,篩選得到18個(gè)在EBV陽性淋巴瘤中表達(dá)上調(diào)的EBV mi RNA和38個(gè)既是生物信息學(xué)軟件預(yù)測出的EBV mi RNA的靶基因也是在EBV陽性淋巴瘤中下調(diào)的m RNA;對(duì)預(yù)測出的18個(gè)EBV mi RNA的靶基因富集獲得了Wnt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等多個(gè)與淋巴瘤發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)的信號(hào)通路;生物學(xué)功能注釋發(fā)現(xiàn)這些EBV mi RNA的靶基因參與了淋巴細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程;EBV mi RNA-m RNA互作分析顯示篩選得到的18個(gè)EBV mi RNA和38個(gè)m RNA中形成68對(duì)調(diào)控關(guān)系,其中ebv-BART11-5p、ebv-BART14-3p、ebv-BART1-3p、ebv-BART6-5p、ebv-BART17-5p、ebv-BART11-3p六個(gè)EBV mi RNA調(diào)控了68對(duì)中的37對(duì),占54%。經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)篩選出的EBV mi RNA進(jìn)行表達(dá)差異檢測,最終ebv-mi R-BART1-5p、ebv-mi R-BART1-3p、ebv-mi RBART5-5p、ebv-mi R-BART6-5p、ebv-mi R-BART6-3p、ebv-mi RBART9、ebv-mi R-BART14-3p、ebv-mi R-BART15、ebv-mi RBART16、ebv-mi R-BART17-5p、ebv-mi R-BART17-3p這11個(gè)EBV mi RNA經(jīng)驗(yàn)證表達(dá)趨勢與芯片結(jié)果一致。結(jié)論通過對(duì)芯片數(shù)據(jù)的挖掘,利用生物信息學(xué)軟件分析,可以獲得在EBV陽性淋巴瘤中表達(dá)上調(diào)的EBV mi RNA及其潛在的靶基因,可有效指導(dǎo)下步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。其中ebv-mi R-BART6-5p在EBV陽性和陰性細(xì)胞中的表達(dá)差異倍數(shù)較大,并且在EBV mi RNA-m RNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中處于重要位置,可進(jìn)一步探討其生物學(xué)功能及作用機(jī)制。第二部分ebv-mi R-BART6-5p對(duì)EBV相關(guān)淋巴瘤細(xì)胞增殖和凋亡影響的研究目的通過體外分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探討ebv-mi R-BART6-5p對(duì)EBV相關(guān)淋巴瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法電穿孔法轉(zhuǎn)染ebv-mi R-BART6-5p沉默和過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)下調(diào)和過表達(dá)的細(xì)胞模型;利用慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)ebv-mi R-BART6-5p的EBV陽性淋巴瘤細(xì)胞模型,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ebv-mi R-BART6-5p的表達(dá)水平;CCK8法測定細(xì)胞生長曲線;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞Akt、Bax、NF-κB p65、Iκκβ蛋白的表達(dá)量。結(jié)果通過電穿孔法構(gòu)建ebv-mi R-BART6-5p表達(dá)下調(diào)細(xì)胞模型BART6-5p inhibitor/Farage和過表達(dá)細(xì)胞模型BART6-5p mimics/Pfeiffer,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ebv-mi R-BART6-5p的表達(dá)量,BART6-5p inhibitor/Farage組低于mi R-sh NC/Farage組和Farage組,BART6-5p mimics/Pfeiffer組高于mi R-sh NC/Pfeiffer組和Pfeiffer組,P0.05;CCK8法檢測細(xì)胞生長曲線結(jié)果示BART6-5p inhibitor/Farage組細(xì)胞增殖力低于mi R-sh NC/Farage組和Farage組,P0.05,BART6-5p mimics/Pfeiffer組細(xì)胞增殖力低于Pfeiffer組細(xì)胞,P0.05,BART6-5p mimics/Pfeiffer組細(xì)胞增殖力與mi R-sh NC/Pfeiffer組細(xì)胞的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示BART6-5p inhibitor/Farage組細(xì)胞凋亡率高于Farage組細(xì)胞,P0.05,BART6-5p inhibitor/Farage組細(xì)胞凋亡率高于mi R-sh NC/Farage組細(xì)胞,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05,BART6-5p mimics/Pfeiffer組細(xì)胞凋亡率高于Pfeiffer組細(xì)胞,P0.05,BART6-5p mimics/Pfeiffer組細(xì)胞凋亡低于mi Rsh NC/Pfeiffer組細(xì)胞,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。利用慢病毒載體成功構(gòu)建了ebv-mi R-BART6-5p穩(wěn)定下調(diào)的GV-BART6-5p down/Farage細(xì)胞模型,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ebv-mi R-BART6-5p的表達(dá)量明顯低于于未轉(zhuǎn)染的Farage細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照病毒的NC/Farage細(xì)胞,P0.05;CCK8測細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示GV-BART6-5p down/Farage組細(xì)胞增殖能力明顯低于Farage和NC/Farage組細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;流式細(xì)胞術(shù)檢測三組細(xì)胞的凋亡率發(fā)現(xiàn)GV-BART6-5p down/Farage組細(xì)胞的凋亡率高于Farage和NC/Farage組細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;Western Blot檢測GV-BART6-5p down/Farage組細(xì)胞中Akt、NF-κB p65、Iκκβ蛋白的表達(dá)量較Farage和NC/Farage組細(xì)胞下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05,Bax蛋白表達(dá)量較Farage組細(xì)胞上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05,較NC/Farage組細(xì)胞表達(dá)量上調(diào),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。結(jié)論ebv-mi R-BART6-5p有促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡的可能,可以上調(diào)細(xì)胞PI3K/Akt、NF-κB信號(hào)通路的活性,抑制凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax的表達(dá)。第三部分ebv-mi R-BART6-5p的靶基因驗(yàn)證目的前期體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)改變EBV陽性淋巴瘤細(xì)胞Farage的ebvmi R-BART6-5p表達(dá)可以影響淋巴瘤細(xì)胞的增殖和凋亡,本部分對(duì)ebvmi R-BART6-5p的靶基因及其結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。方法利用生物信息學(xué)方法預(yù)測靶基因,Western Blot技術(shù)檢測GV-BART6-5p down/Farage、NC/Farage和Farage三組細(xì)胞中靶蛋白表達(dá)量,最后通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)驗(yàn)證靶基因的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測同時(shí)結(jié)合EBV mi RNA-m RNA互作圖,選擇DICER1作為候選靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。Western Blot檢測三組細(xì)胞中DICER1蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn)GV-BART6-5p down/Farage組細(xì)胞中DICER1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于NC/Farage和Farage兩組細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示DICER1為ebv-mi R-BART6-5p調(diào)控的靶基因。結(jié)論ebv-mi R-BART6-5p可以靶向作用于DICER1,DICER1是ebv-mi RBART6-5p調(diào)控的靶基因之一。
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【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.1
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本文編號(hào)：1610509