本文選題：肺癌　切入點(diǎn)：C-Raf　出處：《昆明理工大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：癌癥是指起源于上皮組織的惡性腫瘤,而肺癌則是惡性腫瘤中最常見的一類,是全球死亡率和發(fā)病率最高的癌癥,它給人們的生活和身體帶來極大的威脅。因此研究肺癌的發(fā)病機(jī)制,尋找治療肺癌的新靶點(diǎn)就顯得更為迫切。Raf激酶(Rapidly Accelerated Fibrosarcoma)逆轉(zhuǎn)錄致癌病毒基因包括A-Raf、B-Raf和C-Raf三種亞型,Raf激酶的突變則是細(xì)胞癌變的主要原因之一,A-Raf突變可導(dǎo)致卵巢癌和大腸癌,B-Raf突變和神經(jīng)系統(tǒng)癌變、皮膚癌和胸腺癌相關(guān),C-Raf突變和小細(xì)胞肺癌相關(guān),并且在肺癌組織中C-Raf蛋白的表達(dá)量明顯增加,因此,調(diào)控C-Raf激酶及其結(jié)合蛋白也就成為了治療肺癌的重要手段。然而大多數(shù)癌癥治療方法將注意力集中于單個(gè)靶點(diǎn)或單個(gè)突變,缺乏從系統(tǒng)的高度對動態(tài)的細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識和對其內(nèi)在機(jī)制的深入了解。在本研究中,我們以C-Raf的中心蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)入手,深入調(diào)查了腫瘤細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)在腫瘤發(fā)生中的作用。我們利用蛋白互組,高通量質(zhì)譜分析技術(shù)系統(tǒng)性識別了 C-Raf的相互作用蛋白SMC3(Structural maintenance of chromosomes protein 3)染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白 3 和 PP2A Aα(protein phyosphatase2A Aα)蛋白磷酸酶 2A Aα。SMC3是黏連蛋白重要組成部分,SMC3和SMC1A亞基通過其鉸鏈結(jié)構(gòu)域二聚化形成'V'形狀,這個(gè)'V'與底部的RAD21亞基連接形成一個(gè)封閉的三邊環(huán)狀結(jié)構(gòu),這個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)能夠包圍姐妹染色體從而介導(dǎo)姐妹染色體粘連蛋白的粘附,并在基因調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用,SMC3在S期可以被乙�；�,建立染色質(zhì)加載的粘連蛋白的粘著性,從而影響著細(xì)胞的周期。蛋白磷酸酶PP2A Aα是蛋白磷酸酶PP2A(protein phyosphatase2A,PP2A)的重要組成部分之一。PP2A是絲氨酸蘇氨酸型的蛋白磷酸酶,在大多數(shù)的組織和細(xì)胞中的含量都非常高,它參與著DNA的復(fù)制、基因的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞的分化和凋亡、癌基因的轉(zhuǎn)化等一系列的細(xì)胞生物學(xué)活動,除此之外它還與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有一定的關(guān)系,PP2A Aα蛋白的突變與肺癌、子宮癌的發(fā)生有緊密的聯(lián)系。我們分別構(gòu)建了 SMC3和PP2A Aα蛋白的高表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-SMC3/PP2A Aα),敲減質(zhì)粒(pSUPER-SMC3/PP2A Aα)以及敲除質(zhì)粒(px459-SMC3/PP2A Aα),并穩(wěn)轉(zhuǎn)入到非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中,成功的構(gòu)建了 SMC3/PP2AAα的高表達(dá)和敲減穩(wěn)定細(xì)胞株。最后,我們通過CCK8法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)pSUPER-SMC3后對A549細(xì)胞的增殖情況,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)轉(zhuǎn)pSUPER-SMC3的A549細(xì)胞的增殖能力與對照組(control)和陰性實(shí)驗(yàn)組(pSUPER)相比明顯下降,差異具有顯著性意義(P0.01),證明PSUPER-SMC3的穩(wěn)轉(zhuǎn)抑制A549細(xì)胞的增殖;利用劃痕和Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)pSUPER-SMC3后對A549細(xì)胞遷移的情況,實(shí)驗(yàn)組(PSUPER-SMC3)細(xì)胞數(shù)明顯少于空白對照組和陰性對照組的細(xì)胞數(shù)目,差異具有顯著性意義(P0.05),這就證明下調(diào)SMC3蛋白的表達(dá)確實(shí)會抑制A549細(xì)胞的遷移;用細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測細(xì)胞的成球能力和干性發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞成球數(shù)為(19.667±3.055)明顯少于空白對照組(54.333±4.041)和陰性對照組(54.667±3.786),差異具有顯著性意義(P0.05),而空白對照組和陰性對照組細(xì)胞成球數(shù)無顯著性意義(P0.05),證明了下調(diào)SMC3蛋白的表達(dá)使A549細(xì)胞成球數(shù)減少,干性減弱�？偠灾�,我們挑選和確定了 C-Raf的結(jié)合蛋白SMC3和PP2AAα,并成功構(gòu)建了SMC3和PP2A Aα的高表達(dá)、敲減和敲除質(zhì)粒,隨后穩(wěn)轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞中,成功構(gòu)建了 SMC3和PP2A Aα的高表達(dá)細(xì)胞株和敲減細(xì)胞株。其次證明了 SMC3的沉默會抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和成球能力,減弱細(xì)胞的干性,這些均是癌細(xì)胞生存和腫瘤發(fā)展的重要生物學(xué)功能,因此SMC3有望成為肺癌診斷的新的生物標(biāo)志和治療的藥物靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1610376