本文選題：骨肉瘤　切入點(diǎn)：MAPK7基因　出處：《鄭州大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：MAPK7基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的功能研究目的:骨肉瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤,也是兒童和青少年中的高發(fā)惡性腫瘤之一。生長(zhǎng)迅速和易轉(zhuǎn)移是骨肉瘤的常見(jiàn)特征,因而造成其居高不下的病死率。因此進(jìn)一步探索骨肉瘤癌細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制,是下一代分子靶向抗癌治療的急切需要。染色體中17p11.2區(qū)域的異常擴(kuò)增是許多臨床骨肉瘤的遺傳學(xué)特征,對(duì)這一區(qū)域的進(jìn)一步研究提示了若干潛在的腫瘤生成基因包括PMP22,TOP3A和MAPK7等。PMP22和TOP3A已有報(bào)道可調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞增生,而對(duì)于MAPK7基因,已有臨床觀察指出其可能作為潛在的腫瘤預(yù)后標(biāo)記物。但對(duì)于其具體的促腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用尚無(wú)詳細(xì)描述。本文將以骨肉瘤細(xì)胞系SOSP-M為體外模型,通過(guò)過(guò)表達(dá)和基因靜默的手段,特異性上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞內(nèi)MAPK7基因表達(dá)水平,并運(yùn)用MTT法,劃痕實(shí)驗(yàn)法和Matrigel法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,另外利用流式細(xì)胞術(shù)分析MAPK7基因?qū)?xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。方法:1、培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞系SOSP-M細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞中的MAPK7基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)和敲低,以此作為體外模型,在細(xì)胞水平檢測(cè)MAPK7基因水平的改變?cè)谀[瘤增殖、遷移和侵襲中的作用。2、MAPK7基因的敲低和過(guò)表達(dá):訂制PCDNA-MAPK7質(zhì)粒(1微克每毫升)和siRNA-MAPK7(1微克每毫升),利用PCDNA-MAPK7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞系SOSPM細(xì)胞以使細(xì)胞中MAPK7基因過(guò)表達(dá),過(guò)表達(dá)采用空質(zhì)粒組做對(duì)照;利用siRNAMAPK7轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞系SOSP-M細(xì)胞以敲低細(xì)胞中的MAPK7基因,干擾采用Scramble SiRNA做對(duì)照,。轉(zhuǎn)染的試劑為L(zhǎng)ipofectamine2000TM試劑,以脂質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。3、Western blot分析檢測(cè)MAPK7蛋白表達(dá)水平:將培養(yǎng)的SOSP-M細(xì)胞隨機(jī)分為五組:空白組:無(wú)轉(zhuǎn)染處理,過(guò)表達(dá)對(duì)照組:轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒,過(guò)表達(dá)組:轉(zhuǎn)染PCDNA-MAPK7質(zhì)粒,敲低對(duì)照組:轉(zhuǎn)染Scramble SiRNA,轉(zhuǎn)染敲低組:轉(zhuǎn)染siRNA-mapk7。轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞,提取細(xì)胞的總蛋白,利用westernblot分析,以gapdh為內(nèi)參,檢測(cè)各組中mapk7蛋白表達(dá)水平的差異。4、mapk7基因的表達(dá)水平檢測(cè):將培養(yǎng)的sosp-m細(xì)胞隨機(jī)分為五組:空白組:無(wú)轉(zhuǎn)染處理,過(guò)表達(dá)對(duì)照組:轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒,過(guò)表達(dá)組:轉(zhuǎn)染pcdna-mapk7質(zhì)粒,敲低對(duì)照組:轉(zhuǎn)染scramblesirna,轉(zhuǎn)染敲低組:轉(zhuǎn)染sirna-mapk7。轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞,提取細(xì)胞的總rna,反轉(zhuǎn)錄為cdna,然后利用mapk7基因上下游引物進(jìn)行realtimepcr分析,以gapdh為內(nèi)參,檢測(cè)各組細(xì)胞中目的基因mapk7mrna表達(dá)水平變化。5、細(xì)胞增殖水平觀察:將轉(zhuǎn)染后的五組細(xì)胞傳入96孔板,利用mtt法,記錄在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀570nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度值,生長(zhǎng)曲線的繪制橫軸為時(shí)間,縱軸為吸光度值,在坐標(biāo)軸內(nèi)描出各個(gè)點(diǎn)的位置,連成過(guò)原點(diǎn)的直線,根據(jù)此坐標(biāo)軸計(jì)算生長(zhǎng)抑制率,檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h后各組中細(xì)胞的增殖情況。6、細(xì)胞遷移能力觀察:將轉(zhuǎn)染后的五組細(xì)胞傳入6孔板,利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),觀察劃痕24h后,每組隨機(jī)選取8個(gè)視野,計(jì)算細(xì)胞遷移比率,比較各組的細(xì)胞遷移能力。7、細(xì)胞侵襲能力觀察:將轉(zhuǎn)染后的五組細(xì)胞傳至包被好基底膜的transwell小室中,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)48h后,洗掉膜上的細(xì)胞,染色30min,計(jì)數(shù)每個(gè)100x視野內(nèi)細(xì)胞數(shù),比較各組之間細(xì)胞侵襲情況。8、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的檢測(cè):應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期,分析細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞周期進(jìn)程,以及利用realtimepcr技術(shù)和westernblot技術(shù)分析上皮細(xì)胞間質(zhì)化,即emt過(guò)程中標(biāo)志分子的表達(dá)量變化。9、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用單樣本ks檢驗(yàn)正態(tài)分布檢驗(yàn)處理所有收集的資料。采用卡方檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)處理計(jì)數(shù)資料。測(cè)量數(shù)據(jù)由studentt檢驗(yàn)(兩個(gè)組)或方差分析(anova,超過(guò)三組)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。然后通過(guò)事后tukey檢驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步組間比較。當(dāng)p0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、mapk7表達(dá)水平分析real-timepcr和westernblot分析結(jié)果均顯示,分別與對(duì)照組相比較,轉(zhuǎn)染pcdna-mapk7質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞中mapk7基因表達(dá)水平明顯提高,而轉(zhuǎn)染了sirna-mapk7的腫瘤細(xì)胞中mapk7基因表達(dá)水平明顯降低。表明訂制的pcdna-mapk7質(zhì)粒和sirna-mapk7確實(shí)能夠提高和敲低細(xì)胞中mapk7基因的水平。2、細(xì)胞增殖水平觀察mtt法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示,與空白組相比較,轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒的對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別�？梢�(jiàn)空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)sosp-m細(xì)胞增殖沒(méi)有影響。但轉(zhuǎn)染pcdna-mapk7質(zhì)粒后可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞增殖顯著提高,約為空白組的1.79倍。與scramblesirna組比較,sirna-mapk7轉(zhuǎn)染可以顯著抑制細(xì)胞增殖,只有scramblesirna組的51.8%。結(jié)果表明mapk7基因在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖方面有重要作用。3、mapk7基因?qū)?xì)胞遷移影響在劃痕實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在pcdna-mapk7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,出現(xiàn)了較多的細(xì)胞遷移,而上述現(xiàn)象在sirna-mapk7轉(zhuǎn)染組中遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少。結(jié)果表明,mapk7基因在腫瘤細(xì)胞的遷移過(guò)程中發(fā)揮作用。4、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,mapk7過(guò)表達(dá)顯著增進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲數(shù)目,每個(gè)100x視野內(nèi)12.6個(gè)細(xì)胞,而sirna抑制則可以顯著降低侵襲細(xì)胞數(shù)目,每個(gè)100x視野內(nèi)2.1個(gè)細(xì)胞。5、mapk7能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞凋亡為了檢測(cè)mapk7表達(dá)水平的改變對(duì)骨肉瘤sosp-m細(xì)胞凋亡的影響,我們利用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)過(guò)表達(dá)和干擾mapk7后細(xì)胞發(fā)生凋亡的變化。過(guò)表達(dá)mapk7后顯著抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生,sosp-m細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)與過(guò)表達(dá)對(duì)照組相比下降了約30%;而轉(zhuǎn)染mapk7sirna敲降mapk7后明顯促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生,sosp-m細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)與scramblesirna組相比升高了約2.1倍。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*p0.05)6、mapk7能夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期在證實(shí)了mapk7能夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞sosp-m的細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上,為了研究其調(diào)控細(xì)胞增殖的作用機(jī)制,我們進(jìn)一步研究了mapk7是否參與了細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程。為了檢測(cè)mapk7表達(dá)水平的改變對(duì)骨肉瘤sosp-m細(xì)胞周期的影響,我們利用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)過(guò)表達(dá)和干擾MAPK7后細(xì)胞周期的變化。在SOSP-M細(xì)胞中,與過(guò)表達(dá)對(duì)照組相比過(guò)表達(dá)MAPK7后,G1期的細(xì)胞比例由59.4%減少到37.5%,S期比例由21%升高到34.5%。而轉(zhuǎn)染MAPK7 siRNA干擾MAPK7的表達(dá)后明顯抑制了細(xì)胞周期的進(jìn)程。也就是說(shuō),siRNA-MAPK7干擾MAPK7的表達(dá)后使較多的細(xì)胞累積在G1期,而無(wú)法順利進(jìn)入S期。因此,我們認(rèn)為MAPK7影響了骨肉瘤細(xì)胞SOSP-M從G1期進(jìn)入S期,從而作用于細(xì)胞周期進(jìn)程(*p0.05)結(jié)論:1、MAPK7基因可以促進(jìn)骨肉瘤的增殖。2、MAPK7基因可以促進(jìn)骨肉瘤的遷移。3、MAPK7基因可以促進(jìn)骨肉瘤的侵襲。4、MAPK7能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞凋亡。5、MAPK7能夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R738.1
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本文編號(hào)：1608933