發(fā)布時間：2018-03-13 04:24

  本文選題：肺癌　切入點：TTF-1　出處：《遵義醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：本課題研究內(nèi)容包括兩部分內(nèi)容,第一部分為:TTF-1啟動子調(diào)控miR-7表達(dá)對人肺癌裸鼠模型腫瘤生長的影響;第二部分為:TTF-1啟動子調(diào)控miR-7表達(dá)影響人肺癌模型腫瘤生長的分子機制;分述如下:目的:第一部分:常規(guī)建立人肺癌裸鼠荷瘤模型,結(jié)合HE染色、免疫熒光(Ki-67、TUNEL)、原位雜交、實時熒光定量PCR,觀察TTF-1啟動子靶向表達(dá)miR-7對人肺癌模型腫瘤生長的影響。第二部分:利用腫瘤組織c DNA基因芯片、實時熒光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot等技術(shù),并結(jié)合過表達(dá)靶分子等初步探討TTF-1啟動子靶向調(diào)控miR-7表達(dá)對人肺癌體內(nèi)生長的可能分子機制。方法:第一部分:建立人肺癌裸鼠腫瘤模型。于模型建立后在腫瘤對側(cè)遠(yuǎn)端皮下分別注射100 mg p-T-miR-7重組質(zhì)粒和p-Cont質(zhì)粒(每組各10只),每隔3天注射一次,連續(xù)注射5次,并每3天測量一次腫瘤大小。末次注射3天后,麻醉處死模型小鼠。取腫瘤組織和肺組織,HE染色觀察其組織形態(tài)學(xué)變化;免疫熒光技術(shù)檢測腫瘤組織中增殖核抗原Ki-67蛋白的表達(dá)變化;TUNEL法檢測腫瘤局部細(xì)胞凋亡情況;Real-time PCR和原位雜交檢測腫瘤組織中miR-7的表達(dá);此外,利用Real-time PCR檢測與腫瘤細(xì)胞生長周期相關(guān)的蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)變化,以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)變化。最后,利用Western blot檢測相關(guān)信號途徑,包括Akt/Erk等信號通路的傳遞改變。第二部分:提取人肺癌95D移植瘤模型中p-Cont組和p-T-miR-7組中腫瘤組織,送c DNA基因芯片檢測,篩選出差異表達(dá)基因;進一步運用生物信息學(xué)技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)篩選miR-7可能作用的靶分子,經(jīng)篩選選定NDUFA4作為miR-7的候選靶分子,并用Western blot和免疫組化驗證其表達(dá);進一步通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)靶分子NDUFA4的真核載體(命名為p-NDUFA4);并且將p-NDUFA4體外瞬時轉(zhuǎn)染人肺癌95D細(xì)胞,Real-time PCR檢測NDUFA4的表達(dá)水平;通過CCK-8實驗、劃痕實驗、克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染后NDUFA4對人肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和克隆形成能力的影響;此外,利用Real-time PCR檢測腫瘤細(xì)胞生長周期相關(guān)蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)變化,以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)變化。最后,利用Western blot技術(shù)檢測NDUFA4、Akt、Erk、磷酸化Akt和磷酸化Erk的表達(dá)水平。為了檢測下調(diào)NDUFA4的表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn)TTF-1啟動子調(diào)控miR-7表達(dá)對人肺癌體內(nèi)生長的抑制效應(yīng),我們將p-T-miR-7和p-NDUFA4體外共轉(zhuǎn)染于人肺癌95D細(xì)胞。通過CCK-8實驗、劃痕實驗、克隆形成實驗檢測共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長、遷移和克隆形成能力的變化;此外,利用Real-time PCR檢測腫瘤細(xì)胞中NDUFA4、生長周期相關(guān)蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)變化,以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)變化。最后,利用Western blot技術(shù)檢測Akt、Erk、磷酸化Akt和磷酸化Erk的表達(dá)水平。結(jié)果:第一部分:動態(tài)觀察人肺癌裸鼠模型的腫瘤生長,并統(tǒng)計繪制腫瘤生長曲線。結(jié)果顯示與p-Cont對照組相比,p-T-miR-7實驗組腫瘤生長緩慢(P0.05);荷瘤裸鼠肺組織HE染色結(jié)果顯示:p-Cont對照組荷瘤裸鼠肺部可見明顯的腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移,p-T-miR-7實驗組鏡下并未觀察到明顯的轉(zhuǎn)移灶。腫瘤組織HE染色結(jié)果顯示:p-Cont組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,p-T-miR-7實驗組則可見大片壞死區(qū);Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,p-T-miR-7實驗組中miR-7的表達(dá)顯著的上調(diào)(P0.05);原位雜交結(jié)果顯示:p-T-miR-7實驗組中miR-7的表達(dá)顯著的上調(diào)(P0.05);免疫熒光法檢測顯示:與p-Cont對照組相比,p-T-miR-7實驗組腫瘤組織細(xì)胞Ki-67表達(dá)量顯著減少(P0.05);原位凋亡實驗(TUNEL法)檢測結(jié)果顯示:與p-Cont對照組相比,p-T-miR-7實驗組腫瘤組織局部細(xì)胞的凋亡顯著增加;Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:荷瘤模型腫瘤組織細(xì)胞生長周期相關(guān)的蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)均明顯下調(diào),且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Western blot結(jié)果顯示,荷瘤模型腫瘤組織中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)下調(diào),具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);在細(xì)胞水平上,Western blot結(jié)果也顯示,p-T-miR-7轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào),與體內(nèi)結(jié)果一致(P0.05)。第二部分:腫瘤組織cDNA微陣列芯片分析篩選出大量差異表達(dá)的基因。與p-Cont組相比,p-T-miR-7實驗組NDUFA4的表達(dá)下調(diào)4.13倍;Real-time PCR檢測結(jié)果進一步顯示,p-T-miR-7實驗組NDUFA4在人肺癌荷瘤腫瘤組織中的表達(dá)均較p-Cont對照組顯著下調(diào)(P0.05);此外,在細(xì)胞水平上,p-T-miR-7轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞后NDUFA4的表達(dá)也顯著下調(diào)(P0.05),提示NDUFA4可能是miR-7的靶分子;進一步運用Western blot技術(shù)以及免疫組化實驗檢測發(fā)現(xiàn),與p-Cont對照組相比,腫瘤組織中p-T-miR-7組靶分子NDUFA4蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05);成功構(gòu)建過表達(dá)NDUFA4的真核表達(dá)載體(pc DNA3.1-NDUFA4,命名為p-NDUFA4),并將該載體體外瞬時轉(zhuǎn)染人肺癌95D細(xì)胞;Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:與p-Cont組相比,p-NDUFA4轉(zhuǎn)染組NADUFA的表達(dá)顯著上調(diào)表達(dá)(P0.05);CCK-8法檢測結(jié)果顯示:與p-Cont組相比,p-NDUFA4轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的增殖明顯增加(P0.05);Scratch Assay實驗和克隆形成實驗結(jié)果分別顯示:與p-Cont組相比,p-NDUFA4轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞遷移能力和克隆形成能力均顯著增強(P0.05);與此同時,Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:p-NDUFA4轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞中細(xì)胞生長周期相關(guān)的蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)以及相關(guān)的轉(zhuǎn)移分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)均處于明顯上調(diào),且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);此外,Western blot結(jié)果顯示,與p-Cont組相比,p-NDUFA4轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞內(nèi)NDUFA4、磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)上調(diào),具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);最后,為了驗證改變NDUFA4的表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn)TTF-1啟動子調(diào)控miR-7的表達(dá)對人肺癌的抑制效應(yīng),我們將p-NDUFA4真核過表達(dá)載體,同p-T-miR-7載體于體外瞬時共轉(zhuǎn)染人肺癌95D細(xì)胞來觀察其對細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的可能影響。CCK-8法檢測結(jié)果顯示:與p-T-miR-7單獨轉(zhuǎn)染組相比,p-T-miR-7+p-NDUFA4共轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的增殖明顯增加,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Scratch Assay實驗和克隆形成實驗結(jié)果分別顯示:與p-T-miR-7單獨轉(zhuǎn)染組相比,p-T-miR-7+p-NDUFA4共轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的遷移能力和克隆形成能力也顯著增強(P0.05);Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:p-T-miR-7+p-NDUFA4共轉(zhuǎn)染組NDUFA4的表達(dá)、細(xì)胞生長周期相關(guān)的蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)以及相關(guān)的轉(zhuǎn)移分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)均處于明顯上調(diào),且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);最后,Western blot結(jié)果顯示,與p-T-miR-7單獨轉(zhuǎn)染組相比,p-T-miR-7+p-NDUFA4共轉(zhuǎn)染組中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào),且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);結(jié)論:第一部分:TTF-1啟動子靶向表達(dá)miR-7可以顯著抑制人肺癌細(xì)胞的體內(nèi)生長,該效應(yīng)與Akt/Erk信號通路傳遞變化有關(guān)。第二部分:miR-7可靶向調(diào)控NDUFA4的表達(dá),并且過表達(dá)NDUFA4可逆轉(zhuǎn)TTF-1啟動子調(diào)控miR-7表達(dá)對人肺癌細(xì)胞生長與轉(zhuǎn)移的抑制效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2;R-332

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本文編號：1604803