本文選題：癌相關成纖維細胞　切入點：氧化型ATM　出處：《重慶醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一章 氧化型ATM對乳腺癌CAFs細胞增殖的調控作用及其機制研究目的：探討氧化型ATM對乳腺癌CAFs增殖的調控作用及其機制。方法：(1)以課題組前期構建的永生化乳腺癌NFs和CAFs為模型,采用MTT法、生長密度實驗、流式細胞分析和蛋白印跡實驗檢測乳腺癌CAFs的異常增殖行為。(2)蛋白印跡、細胞免疫熒光和免疫組化實驗檢測乳腺癌NFs和CAFs中p-ATM(s1981)、ATM和γH2AX(s139)的蛋白表達量。各種ROS抑制劑處理乳腺癌CAFs, DCFH熒光探針實驗檢測乳腺癌CAFs中ROS含量改變,蛋白印跡實驗檢測CAFs細胞ATM氧化活化的改變。(3)應用ATM特異抑制劑KU60019和siRNA技術抑制乳腺癌CAFs中氧化型ATM功能,觀察氧化型ATM功能缺失對乳腺癌CAFs增殖的作用。(4)用KU60019和NAC同時處理乳腺癌CAFs,分析NAC對ATM功能缺失所致CAFs增殖缺陷的影響。(5)使用KU60019處理CAFs,蛋白印跡實驗檢測KU60019對MEK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信號通路活性的影響。采用U0126、LY294002和XAV939抑制劑處理CAFs,檢測MEK-MAPK.PI3K-AKT和WNT信號通路失活對CAFs增殖的作用。(6)用KU60019、U0126、LY294002和XAV939處理CAFs,蛋白印跡檢測ATM功能、MEK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信號通路失活對CAFs中GSK3β、 β-catenin和c-Myc蛋白表達的影響。同樣條件下,ChIP實驗檢測處理前后CAFs細胞β-catenin轉錄活性的改變。運用siRNA技術敲除CAFs中c-Myc,觀察c-Myc敲除對CAFs增殖的影響。結果：(1)MTT實驗、細胞密度實驗、流式細胞分析和蛋白印跡實驗的結果顯示,與NFs相比,CAFs增殖速度快、生長密度大、S期細胞比例高以及細胞增殖正向調控蛋白表達升高,這說明乳腺癌CAFs具有異常增殖表型。(2)與NFs相比,CAFs中p-ATM (s1981), ATM和p-AKT (s473)蛋白表達升高,γH2AX (s139)蛋白表達無變化。在各種ROS抑制劑處理下,只有NAC、DPI和rotenone能降低CAFs細胞中的ROS水平和p-ATM (s1981)蛋白表達量。(3)與對照相比,KU60019抑制或ATM基因敲除明顯抑制CAFs增殖速率、降低CAFs生長密度、減少CAFsS期細胞比例、抑制細胞增殖正向調控蛋白表達,這說明氧化型ATM具有促CAFs增殖作用。(4)與溶劑對照相比,NAC能逆轉KU60019處理所致CAFs細胞OS,但僅能小部分逆轉KU60019所導致的CAFs增殖缺陷。(5)蛋白印跡實驗結果顯示,KU60019顯著抑制CAFs中ERK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信號通路活性。與溶劑對照相比,U0126、LY294002和XAV939單獨或聯(lián)合處理抑制CAFs增殖。(6)蛋白印跡實驗結果表明,KU60019、U0126、LY294002和XAV939均能增強GSK3β激酶活性,抑制β-catenin和c-Myc蛋白表達。ChIP實驗結果顯示,KU60019、U0126、LY294002和XAV939均能阻斷P-catenin轉錄活性。與對照相比,c-Myc敲除能抑制CAFs增殖。結論：(1)與乳腺癌NFs細胞相比,乳腺癌CAFs具有異常增殖表型。(2)乳腺癌CAFs中存在非DSBs依賴性ATM氧化活化現(xiàn)象。(3)氧化型ATM促乳腺癌CAFs增殖。(4)氧化型ATM氧化還原維持功能對乳腺癌CAFs增殖調控作用有限。(5)氧化型ATM主要通過增強ERK-MAPK, PI3K-AKT和WNT信號通路活性促進乳腺癌CAFs細胞增殖。(6)β-Catenin/c-Myc軸介導氧化型ATM促CAFs增殖功能。第二章 氧化型ATM對低氧乳腺癌CAFs細胞EMR的調控作用及其機制研究目的：研究氧化型ATM對低氧乳腺癌CAFs細胞EMR的調控作用及其機制。方法：(1)分析乳腺癌CAFs/NFs mRNA表達芯片,挖掘乳腺癌CAFs細胞中異常表達的能量代謝相關基因,qRT-PCR法驗證。與常氧NFs相比,葡萄糖消耗速率、乳酸產(chǎn)生速率、蛋白印跡、線粒體活性和電鏡等實驗檢測低氧對CAFs EMR的影響。(2)與溶劑對照相比,探討抗氧化劑NAC和線粒體呼吸鏈復合酶體Ⅲ抑制劑rotenone對低氧CAFs EMR的影響。(3)以溶劑為對照,蛋白印跡實驗檢測NAC和rotenone對低氧CAFs ATM氧化活化的作用。用KU60019處理CAFs,探討氧化型ATM功能缺失對低氧CAFs EMR的影響。(4)采用磷酸化蛋白質組學技術和生物信息學技術篩選低氧CAFs氧化型ATM下游潛在的能量代謝相關底物。結果：(1)mRNA芯片和qRT-PCR實驗結果顯示,在乳腺癌CAFs中,許多糖酵解基因表達上調,很多OP基因表達下調,能量代謝相關信號通路異常活化。與常氧NFs相比,低氧CAFs的葡萄糖消耗速率和乳酸產(chǎn)生速率明顯升高,促能量代謝蛋白表達上調,線粒體活性被嚴重抑制,線粒體嵴和數(shù)量顯著減少。這表明低氧誘導CAFs細胞具有典型的EMR表型。(2)ROS水平檢測、蛋白印跡和代謝實驗結果表明,NAC和rotenone抑制低氧CAFs細胞ROS升高和EMR。(3)蛋白印跡實驗的結果顯示,NAC和rotenone抑制低氧CAFs ATM的氧化活化。蛋白印跡和代謝實驗的結果表明,氧化型ATM功能喪失抑制低氧乳腺癌CAFs EMR。這表明,氧化型ATM具有促進低氧CAFs EMR功能。(4)磷酸化蛋白質組學實驗和生物信息學分析結果顯示,低氧CAFs細胞氧化型ATM下游具有許多新的潛在的能量代謝相關底物。結論：(1)低氧誘導乳腺癌CAFs產(chǎn)生典型的EMR表型。(2)線粒體來源的ROS介導低氧乳腺癌CAFs細胞EMR。(3)線粒體來源的ROS氧化活化低氧乳腺癌CAFs細胞ATM激酶。氧化型ATM促進低氧乳腺癌CAFs EMR。 (4)氧化型ATM可能通過磷酸化新的能量代謝相關底物調控低氧乳腺癌CAFs EMR。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

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本文編號：1602022