本文選題：癌相關(guān)成纖維細(xì)胞　切入點(diǎn)：氧化型ATM　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：第一章 氧化型ATM對(duì)乳腺癌CAFs細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及其機(jī)制研究目的：探討氧化型ATM對(duì)乳腺癌CAFs增殖的調(diào)控作用及其機(jī)制。方法：(1)以課題組前期構(gòu)建的永生化乳腺癌NFs和CAFs為模型,采用MTT法、生長(zhǎng)密度實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞分析和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌CAFs的異常增殖行為。(2)蛋白印跡、細(xì)胞免疫熒光和免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌NFs和CAFs中p-ATM(s1981)、ATM和γH2AX(s139)的蛋白表達(dá)量。各種ROS抑制劑處理乳腺癌CAFs, DCFH熒光探針實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌CAFs中ROS含量改變,蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAFs細(xì)胞ATM氧化活化的改變。(3)應(yīng)用ATM特異抑制劑KU60019和siRNA技術(shù)抑制乳腺癌CAFs中氧化型ATM功能,觀察氧化型ATM功能缺失對(duì)乳腺癌CAFs增殖的作用。(4)用KU60019和NAC同時(shí)處理乳腺癌CAFs,分析NAC對(duì)ATM功能缺失所致CAFs增殖缺陷的影響。(5)使用KU60019處理CAFs,蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KU60019對(duì)MEK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信號(hào)通路活性的影響。采用U0126、LY294002和XAV939抑制劑處理CAFs,檢測(cè)MEK-MAPK.PI3K-AKT和WNT信號(hào)通路失活對(duì)CAFs增殖的作用。(6)用KU60019、U0126、LY294002和XAV939處理CAFs,蛋白印跡檢測(cè)ATM功能、MEK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信號(hào)通路失活對(duì)CAFs中GSK3β、 β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)的影響。同樣條件下,ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)處理前后CAFs細(xì)胞β-catenin轉(zhuǎn)錄活性的改變。運(yùn)用siRNA技術(shù)敲除CAFs中c-Myc,觀察c-Myc敲除對(duì)CAFs增殖的影響。結(jié)果：(1)MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞密度實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞分析和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,與NFs相比,CAFs增殖速度快、生長(zhǎng)密度大、S期細(xì)胞比例高以及細(xì)胞增殖正向調(diào)控蛋白表達(dá)升高,這說(shuō)明乳腺癌CAFs具有異常增殖表型。(2)與NFs相比,CAFs中p-ATM (s1981), ATM和p-AKT (s473)蛋白表達(dá)升高,γH2AX (s139)蛋白表達(dá)無(wú)變化。在各種ROS抑制劑處理下,只有NAC、DPI和rotenone能降低CAFs細(xì)胞中的ROS水平和p-ATM (s1981)蛋白表達(dá)量。(3)與對(duì)照相比,KU60019抑制或ATM基因敲除明顯抑制CAFs增殖速率、降低CAFs生長(zhǎng)密度、減少CAFsS期細(xì)胞比例、抑制細(xì)胞增殖正向調(diào)控蛋白表達(dá),這說(shuō)明氧化型ATM具有促CAFs增殖作用。(4)與溶劑對(duì)照相比,NAC能逆轉(zhuǎn)KU60019處理所致CAFs細(xì)胞OS,但僅能小部分逆轉(zhuǎn)KU60019所導(dǎo)致的CAFs增殖缺陷。(5)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,KU60019顯著抑制CAFs中ERK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信號(hào)通路活性。與溶劑對(duì)照相比,U0126、LY294002和XAV939單獨(dú)或聯(lián)合處理抑制CAFs增殖。(6)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,KU60019、U0126、LY294002和XAV939均能增強(qiáng)GSK3β激酶活性,抑制β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,KU60019、U0126、LY294002和XAV939均能阻斷P-catenin轉(zhuǎn)錄活性。與對(duì)照相比,c-Myc敲除能抑制CAFs增殖。結(jié)論：(1)與乳腺癌NFs細(xì)胞相比,乳腺癌CAFs具有異常增殖表型。(2)乳腺癌CAFs中存在非DSBs依賴性ATM氧化活化現(xiàn)象。(3)氧化型ATM促乳腺癌CAFs增殖。(4)氧化型ATM氧化還原維持功能對(duì)乳腺癌CAFs增殖調(diào)控作用有限。(5)氧化型ATM主要通過(guò)增強(qiáng)ERK-MAPK, PI3K-AKT和WNT信號(hào)通路活性促進(jìn)乳腺癌CAFs細(xì)胞增殖。(6)β-Catenin/c-Myc軸介導(dǎo)氧化型ATM促CAFs增殖功能。第二章 氧化型ATM對(duì)低氧乳腺癌CAFs細(xì)胞EMR的調(diào)控作用及其機(jī)制研究目的：研究氧化型ATM對(duì)低氧乳腺癌CAFs細(xì)胞EMR的調(diào)控作用及其機(jī)制。方法：(1)分析乳腺癌CAFs/NFs mRNA表達(dá)芯片,挖掘乳腺癌CAFs細(xì)胞中異常表達(dá)的能量代謝相關(guān)基因,qRT-PCR法驗(yàn)證。與常氧NFs相比,葡萄糖消耗速率、乳酸產(chǎn)生速率、蛋白印跡、線粒體活性和電鏡等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低氧對(duì)CAFs EMR的影響。(2)與溶劑對(duì)照相比,探討抗氧化劑NAC和線粒體呼吸鏈復(fù)合酶體Ⅲ抑制劑rotenone對(duì)低氧CAFs EMR的影響。(3)以溶劑為對(duì)照,蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NAC和rotenone對(duì)低氧CAFs ATM氧化活化的作用。用KU60019處理CAFs,探討氧化型ATM功能缺失對(duì)低氧CAFs EMR的影響。(4)采用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)篩選低氧CAFs氧化型ATM下游潛在的能量代謝相關(guān)底物。結(jié)果：(1)mRNA芯片和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在乳腺癌CAFs中,許多糖酵解基因表達(dá)上調(diào),很多OP基因表達(dá)下調(diào),能量代謝相關(guān)信號(hào)通路異�；罨�。與常氧NFs相比,低氧CAFs的葡萄糖消耗速率和乳酸產(chǎn)生速率明顯升高,促能量代謝蛋白表達(dá)上調(diào),線粒體活性被嚴(yán)重抑制,線粒體嵴和數(shù)量顯著減少。這表明低氧誘導(dǎo)CAFs細(xì)胞具有典型的EMR表型。(2)ROS水平檢測(cè)、蛋白印跡和代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NAC和rotenone抑制低氧CAFs細(xì)胞ROS升高和EMR。(3)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,NAC和rotenone抑制低氧CAFs ATM的氧化活化。蛋白印跡和代謝實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,氧化型ATM功能喪失抑制低氧乳腺癌CAFs EMR。這表明,氧化型ATM具有促進(jìn)低氧CAFs EMR功能。(4)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,低氧CAFs細(xì)胞氧化型ATM下游具有許多新的潛在的能量代謝相關(guān)底物。結(jié)論：(1)低氧誘導(dǎo)乳腺癌CAFs產(chǎn)生典型的EMR表型。(2)線粒體來(lái)源的ROS介導(dǎo)低氧乳腺癌CAFs細(xì)胞EMR。(3)線粒體來(lái)源的ROS氧化活化低氧乳腺癌CAFs細(xì)胞ATM激酶。氧化型ATM促進(jìn)低氧乳腺癌CAFs EMR。 (4)氧化型ATM可能通過(guò)磷酸化新的能量代謝相關(guān)底物調(diào)控低氧乳腺癌CAFs EMR。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：1602022