本文選題：EPSH　切入點(diǎn)：肺腺癌　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的目前,肺癌仍是世界范圍內(nèi)腫瘤死亡的首要原因,其5年總生存率低于20%。在非小細(xì)胞肺癌中,腺癌是非吸煙者中發(fā)生率最高的類型,約占全部肺癌的40%以上,在我國其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),在美國等發(fā)達(dá)國家已超越鱗癌居首位。除了手術(shù)治療,放化療及靶向治療是治療肺腺癌的重要手段。在個(gè)體化治療及精準(zhǔn)醫(yī)療的大背景下,為了更好的治療肺腺癌,延長(zhǎng)腫瘤患者的生存時(shí)間,肺癌的個(gè)體化治療方案也在不斷改進(jìn)和更新,但是,肺腺癌作為異質(zhì)性很高的惡性腫瘤,有相當(dāng)比例的患者對(duì)藥物治療或放療不敏感,甚至出現(xiàn)抵抗。如何提高肺腺癌藥物治療及放射治療的敏感性,仍是目前研究的熱點(diǎn)和難題。EPSH家族是一類新型膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白,可以參與胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的各個(gè)步驟,并起調(diào)控作用。EPSH主要定位于胞膜,除參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控外,也具有有核質(zhì)穿梭的功能,本課題組前期研究表明,EPSH在多個(gè)細(xì)胞系中可以調(diào)節(jié)多種膜蛋白的內(nèi)吞和降解及DNA的損傷修復(fù)過程,雖然EPSH具有調(diào)控多種受體轉(zhuǎn)運(yùn)及其下游信號(hào)傳導(dǎo)的特性,但是它在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未完全明了,而EPSH與肺腺癌治療敏感性的相關(guān)性更是知之甚少。首先我們分析手術(shù)肺腺癌患者臨床病理信息,對(duì)比分析EPSH在正常肺組織和不同亞型肺腺癌組織的表達(dá)水平和組織定位情況,探討EPSH水平及定位差異與肺腺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及生存期的影響。應(yīng)用EPSH表達(dá)水平不同的多種肺腺癌細(xì)胞系為模型,觀察EPSH及其不同突變體對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移、藥敏及成瘤性的影響,一方面驗(yàn)證肺腺癌中EPSH的野生型及不同突變體對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)及E鈣黏蛋白的調(diào)控,另一方面探討EPSH通過對(duì)DNA損傷修復(fù)因子的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控影響肺腺癌治療敏感性的可能機(jī)制。研究方法:1.Western Blotting及免疫組化檢測(cè)EPSH在肺腺癌組織及配對(duì)癌旁正常肺組織中的表達(dá)情況,比較其表達(dá)水平及定位差異,進(jìn)一步分析EPSH表達(dá)定位與肺腺癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性及生存分析,明確EPSH對(duì)肺腺癌患者無病生存期及總生存期的關(guān)系,并分析EPSH表達(dá)與E鈣黏蛋白等表達(dá)的相關(guān)性。2.通過Western Blotting和免疫熒光技術(shù)分別驗(yàn)證內(nèi)源性EPSH在多種肺癌細(xì)胞中的表達(dá)和定位情況。3.構(gòu)建EPSH降表達(dá),多種功能突變體及對(duì)照慢病毒表達(dá)質(zhì)粒,感染A549細(xì)胞,用Western Blotting技術(shù)驗(yàn)證EPSH不同活性突變體對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體,E鈣黏蛋白等的表達(dá)情況及定位的影響。將EPSH不同突變體過表達(dá)和對(duì)照慢病毒表達(dá)質(zhì)粒,感染PC9細(xì)胞,用Western Blotting技術(shù)驗(yàn)證EPSH過表達(dá)效果及對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體,E鈣黏蛋白等表達(dá)情況的影響。4.應(yīng)用免疫熒光技術(shù),激光共聚焦顯微鏡觀察EPSH和表皮生長(zhǎng)因子受體野生型及突變型的共定位狀況,利用EGF刺激,觀察二者定位情況5.二維克隆及劃痕遷移實(shí)驗(yàn),探討EPSH及不同突變體對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖及運(yùn)動(dòng)能力影響。6.裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn),檢測(cè)EPSH野生型及不同突變體對(duì)PC9細(xì)胞在BALB/C-nu鼠體內(nèi)成瘤能力的影響。7.采用小劑量間歇誘導(dǎo)的方法建立肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞系,并鑒定其耐藥特性及生物學(xué)特性。8.免疫熒光檢測(cè)耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞內(nèi)EPSH的表達(dá)水平及定位情況,并檢測(cè)藥物耐受情況。9.應(yīng)用Western Blotting檢測(cè)耐藥前后EPSH表達(dá)情況,同時(shí)建立EPSH降表達(dá)慢病毒,感染耐藥細(xì)胞,Western Blotting技術(shù)檢測(cè)EPSH降表達(dá)對(duì)耐藥的影響。10.裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn),觀察耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞成瘤性差異及對(duì)藥物的敏感性。11.采用大劑量分割照射建立肺腺癌放射抵抗細(xì)胞系,并鑒定其放射抵抗特性及生物學(xué)特性。12.應(yīng)用Western Blotting檢測(cè)放射抵抗前后EPSH的表達(dá)情況及定位情況變化,同時(shí)建立EPSH降表達(dá)及核轉(zhuǎn)運(yùn)突變的慢病毒,感染耐放射細(xì)胞及親本細(xì)胞,觀察細(xì)胞放射敏感性變化,免疫熒光技術(shù)檢測(cè)EPSH對(duì)P53B等DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白定位及表達(dá)水平的影響。13.裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn),觀察放射抵抗細(xì)胞與親本細(xì)胞成瘤性差異,及對(duì)放射的敏感性差異。結(jié)果:1.免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與癌旁正常肺組織相比,肺癌組織中EPSH表達(dá)水平明顯下調(diào);2.免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn),EPSH在正常肺組織呈胞膜表達(dá),部分伴隨胞漿表達(dá),多數(shù)肺腺癌組織中EPSH呈陰性表達(dá),而與正常肺組織相比,肺腺癌組織呈現(xiàn)胞核EPSH表達(dá)陽性但胞膜表達(dá)下降甚至消失的趨勢(shì)。3.生存分析顯示,EPSH總體表達(dá)量高預(yù)后較好,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,分層分析發(fā)現(xiàn)EPSH胞核高表達(dá)組5年DFS及OS均優(yōu)于胞核低表達(dá)組(P=0.0140.004),EPSH胞漿表達(dá)及間質(zhì)表達(dá)對(duì)生存期無顯著影響。多因素分析發(fā)現(xiàn)EPSH胞核高表達(dá)是影響肺腺癌手術(shù)患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及生存期的獨(dú)立因素。4.EPSH胞核表達(dá)與E鈣黏蛋白水平負(fù)相關(guān),公認(rèn)預(yù)后最差的以實(shí)性為主型腺癌更多出現(xiàn)EPSH核表達(dá)陰性(P=0.038)。5.A549細(xì)胞中EPSH的表達(dá)呈中等水平,而PC9細(xì)胞中EPSH表達(dá)很弱。A549細(xì)胞EPSH主要定位于胞膜、胞漿,而PC9細(xì)胞中表皮生長(zhǎng)因子受體及E鈣黏蛋白表達(dá)水平較高,因此將二者作為研究對(duì)象。6.激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,在A549細(xì)胞中,EPSH和表皮生長(zhǎng)因子受體存在共定位,EGF刺激條件下,這一現(xiàn)象更為明顯。7.成功構(gòu)建EPSH膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的不同功能結(jié)構(gòu)域突變體,其參與表皮生長(zhǎng)因子受體等膜蛋白的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)過程。8.通過EGF刺激或?qū)氡砥どL(zhǎng)因子受體的激活突變體,均存在EPSH參與的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控。9.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)EPSH不同突變體可以影響肺腺癌細(xì)胞的增殖,遷移能力及體內(nèi)成瘤能力,并且可以影響對(duì)化療藥物及放射的敏感性。10.小劑量間歇誘導(dǎo)法建立成功兩株肺腺癌耐藥細(xì)胞株,與親本細(xì)胞相比,耐藥細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,表現(xiàn)為由多邊形變?yōu)樗笮?耐藥株二維克隆形成能力減弱,生長(zhǎng)緩慢,耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào),EMT指標(biāo)明顯改變,呈間質(zhì)細(xì)胞表型。細(xì)胞耐藥后,EPSH表達(dá)上升。11.耐藥細(xì)胞EPSH表達(dá)明顯升高,降表達(dá)EPSH后,耐藥水平明顯下降。12.進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí),降表達(dá)EPSH后,耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加。13.應(yīng)用常規(guī)劑量和超分割大劑量照射建立放射抵抗細(xì)胞株,經(jīng)過多次反復(fù)照射,A549,PC9等對(duì)放射敏感程度明顯下降,放射抵抗細(xì)胞二維克隆能力明顯減弱,成瘤能力明顯減弱,但對(duì)放射的敏感性明顯下降。13.照射處理后,多種肺腺癌細(xì)胞EPSH水平明顯上調(diào),表皮生長(zhǎng)因子受體水平升高,EMT相關(guān)指標(biāo)明顯改變,放射抵抗細(xì)胞株形態(tài)向“間質(zhì)細(xì)胞”形態(tài)變化。14.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)放射抵抗細(xì)胞感染EPSH不同突變體以及降表達(dá)質(zhì)粒后,對(duì)射線的敏感性明顯改變;15.EPSH及其入核突變體可以影響DNA損傷因子P53B的入核過程,從而影響放射抵抗細(xì)胞的放射敏感性。結(jié)論:1.與正常肺組織相比,EPSH在肺癌組織中明顯下調(diào),并呈現(xiàn)以胞核表達(dá)為主,胞膜表達(dá)減少的趨勢(shì);EPSH核表達(dá)影響肺腺癌患者生存和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。2.在肺腺癌細(xì)胞系中,EPSH不同結(jié)構(gòu)域突變調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子受體,E鈣黏蛋白等轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞增殖及侵襲遷移,不同突變體影響體內(nèi)腫瘤的形成。3.耐藥細(xì)胞中EPSH表達(dá)明顯上調(diào),降表達(dá)后耐藥性下降,表明其參與肺腺癌的耐藥,其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。4.EPSH不僅具有膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能,而且具有核功能,其調(diào)控?fù)p傷修復(fù)因子P53B入核過程可以參與肺腺癌的放射抵抗;5.EPSH作為新型膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,及其膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能及核功能可能是參與調(diào)控肺腺癌發(fā)生發(fā)展以及耐藥及放射抵抗,其復(fù)雜的腫瘤生物學(xué)作用尚待更深入的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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