本文選題：HBV感染相關(guān)肝癌　切入點(diǎn)：HBV　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是我國肝細(xì)胞肝癌發(fā)生的主要原因,乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在HBV感染所致肝癌的發(fā)生過程中具有重要的作用。作為多功能調(diào)節(jié)蛋白,HBx參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增殖和遷移等多種細(xì)胞內(nèi)過程。HBx作為一個(gè)反式激活子,可以和轉(zhuǎn)錄因子相互作用進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)。有研究表明許多細(xì)胞內(nèi)基因,增強(qiáng)子/啟動(dòng)子元件,轉(zhuǎn)錄因子如(AP)-1、NF-κB、CREB、(ATF)/cAMP等參與HBx介導(dǎo)的肝癌發(fā)生。然而,HBx通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的具體機(jī)制至今尚未明確。ARID2(AT-rich interactive domain-containing protein 2)基因是SWI/SNF復(fù)合物中PBAF(Polybromo-associated BRG1-associated factor)家族的一個(gè)亞基。ARID2有2個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域:即N-端保守的ARID結(jié)構(gòu)域和C-端兩個(gè)保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)。鋅指結(jié)構(gòu)不僅能結(jié)合DNA,也能結(jié)合RNA,蛋白質(zhì)等。ARID相關(guān)蛋白通過核受體參與配體依賴的轉(zhuǎn)錄激活,具有細(xì)胞系基因調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期控制等多種生物學(xué)功能,ARID2基因也參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來,在多種實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)ARID2存在失活突變,如肝癌,黑色素瘤,非小細(xì)胞肺癌,胃癌等。本課題組之前研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中ARID2的表達(dá)明顯下調(diào),且ARID2的低表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖遷移能力密切相關(guān)。本研究旨在深入觀察hbx對arid2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及調(diào)控的具體分子機(jī)制,以進(jìn)一步理解hbv參與肝細(xì)胞癌發(fā)生的致病機(jī)理。方法:1)分別在hbv復(fù)制的肝癌細(xì)胞、hbx瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)肝癌細(xì)胞株以及hbv轉(zhuǎn)基因小鼠中,通過westernblot檢測arid2的表達(dá)水平。在hbv相關(guān)肝癌組織標(biāo)本中,通過免疫組化檢測arid2的蛋白表達(dá)水平,通過real-timepcr技術(shù)檢測arid2與hbx表達(dá)水平的相關(guān)性;2)在肝癌細(xì)胞中,構(gòu)建arid2啟動(dòng)子pgl3-arid2和間隔逐段缺失的arid2啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,觀察hbx對arid2啟動(dòng)子活性的影響及hbx調(diào)控arid2啟動(dòng)子的關(guān)鍵區(qū)域;chip(染色質(zhì)免疫共沉淀)觀察hbx調(diào)控arid2基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合變化;3)根據(jù)篩出的關(guān)鍵區(qū)域?qū)ふ姨禺愋赞D(zhuǎn)錄因子,在肝癌細(xì)胞中通過雙熒光素酶活性、染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)、免疫共沉淀(immunoprecipitation,ip)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證;4)在穩(wěn)定表達(dá)hbx的肝癌細(xì)胞中觀察arid2過表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖、遷移能力的改變。結(jié)果:westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):在肝癌細(xì)胞和hbv轉(zhuǎn)基因小鼠中,hbv復(fù)制可以下調(diào)arid2表達(dá),其中hbx可以顯著下調(diào)arid2蛋白的表達(dá),其他蛋白如hbc,hbs作用不顯著;相比野生型hbv復(fù)制肝癌細(xì)胞,hbv復(fù)制細(xì)胞中含hbx缺失突變可以有效回復(fù)arid2的表達(dá),在此基礎(chǔ)上外源性補(bǔ)充hbx蛋白,arid2的回復(fù)表達(dá)被拮抗;在肝癌細(xì)胞中,瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)hbx均可以明顯下調(diào)arid2的表達(dá)。免疫組化發(fā)現(xiàn):在hbv相關(guān)肝癌組織標(biāo)本中,與癌旁組織相比,腫瘤組織中arid2表達(dá)明顯下調(diào);相關(guān)性分析表明hbx與arid2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與pgl3-basic相比,arid2基礎(chǔ)活性增高顯著,約15倍;過表達(dá)hbx后,arid2啟動(dòng)子活性受到明顯抑制,且呈劑量依賴關(guān)系;hbx調(diào)控arid2基因表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)域位于啟動(dòng)子上游-1040to-601bp附近;chip(染色質(zhì)免疫共沉淀)實(shí)驗(yàn)證實(shí)hbx不能直接作用于arid2啟動(dòng)子區(qū)。提示hbx在轉(zhuǎn)錄水平間接抑制arid2的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件預(yù)測、real-timepcr和westernblot篩選出差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子atoh1;雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):過表達(dá)atoh1可回復(fù)hbx介導(dǎo)的arid2轉(zhuǎn)錄抑制作用;在穩(wěn)定表達(dá)hbx的肝癌細(xì)胞系中,過表達(dá)atoh1可使hbx介導(dǎo)的arid2抑制作用消失;chip實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:過表達(dá)hbx可以抑制atoh1結(jié)合于arid2的啟動(dòng)子區(qū);atoh1敲低后arid2的表達(dá)下調(diào);雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與野生型相比較,hbx對atoh1結(jié)合位點(diǎn)突變的arid2抑制活性幾乎完全消除。ip實(shí)驗(yàn)證實(shí):hbx不能與atoh1直接結(jié)合。綜上,hbx通過抑制atoh1表達(dá)進(jìn)而轉(zhuǎn)錄抑制arid2的表達(dá)。transwell和edu實(shí)驗(yàn)證實(shí):過表達(dá)arid2能夠部分逆轉(zhuǎn)hbx促肝癌細(xì)胞遷移和增殖效應(yīng)。westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):過表達(dá)arid2誘導(dǎo)emt標(biāo)志物e-cadherin的蛋白表達(dá)增加。結(jié)論:hbx通過轉(zhuǎn)錄因子atoh1間接抑制arid2的表達(dá)。hbx下調(diào)arid2的表達(dá),促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和增殖能力,進(jìn)而參與hbv相關(guān)肝癌發(fā)生發(fā)展。本研究為HBx參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展提供了新的理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;Hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma at the miRNA level[J];World Journal of Gastroenterology;2011年28期

2 Asmaa Ibrahim Gomaa;Shahid A Khan;Mireille B Toledano;Imam Waked;Simon D Taylor- Robinson;;Hepatocellular carcinoma: Epidemiology, risk factors and pathogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2008年27期

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本文編號：1596111