本文選題：肝細(xì)胞肝癌　切入點(diǎn)：p53　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma HCC)作為最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌,發(fā)病率在惡性腫瘤中排第五位;肝細(xì)胞肝癌治療效果差,五年生存率低,死亡率在惡性腫瘤中居第三位。肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生是由于肝臟的基礎(chǔ)性疾病,特別與肝炎后肝硬化密切相關(guān)。在東南亞地區(qū),HBV或者HCV感染引起的慢性肝炎是導(dǎo)致肝癌高發(fā)的主要原因。肝細(xì)胞肝癌發(fā)生的機(jī)制是非常復(fù)雜的,包括慢性炎癥,過(guò)氧化應(yīng)激及多種基因異常,例如研究最廣泛的抑癌基因p53突變導(dǎo)致其失活,beta-catenin的突變,過(guò)表達(dá)多種ErbB受體家族,過(guò)表達(dá)MET受體,microRNA的異常表達(dá)以及表觀遺傳的異常等。這些因素都參與了肝細(xì)胞肝癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過(guò)程。大量研究表明microRNA在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用。Victor Ambros和GaryRuvkun于1993年報(bào)道了一類(lèi)非編碼的小分子RNA,即微小RNA(micro RNA,miRNA),此發(fā)現(xiàn)使人類(lèi)重新認(rèn)識(shí)到非編碼RNA對(duì)于細(xì)胞的生命活動(dòng)中具有重要的調(diào)控作用,開(kāi)辟了分子生物學(xué)全新的研究領(lǐng)域。MicroRNA由22~24個(gè)核苷酸組成,屬于進(jìn)化保守的短鏈非編碼RNA,剪切形成雙鏈互補(bǔ)的RNA(dsRNA)。microRNA主要通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因?qū)崿F(xiàn)調(diào)控,MicroRNA的靶向結(jié)合mRNA并非絕對(duì)嚴(yán)格的,即一個(gè)micro RNA可以結(jié)合多個(gè)甚至上百個(gè)基因編碼的mRNA,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因的調(diào)控。一般來(lái)講,micro RNA主要與基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)結(jié)合,從而促進(jìn)RNA酶對(duì)其進(jìn)行降解,或者抑制mRNA的翻譯過(guò)程。最新的研究表明microRNA還能夠與mRNA的5'非翻譯區(qū)(5'UTR)及翻譯區(qū)結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的調(diào)控,還能夠與長(zhǎng)的非編碼RNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA(cRNA)結(jié)合,間接實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控功能,而且microRNA對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控功能不僅限于抑制基因的表達(dá),還能通過(guò)促進(jìn)mRNA的翻譯過(guò)程,達(dá)到提高基因表達(dá)水平的功能。MicroRNA在發(fā)育、分化、增殖和凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)在多種疾病中microrna的表達(dá)異常,并且這些microrna在疾病中的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。近些年研究表明,在downsyndrome模型中,microrna1246(mir-1246)可做為p53基因的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn),并且發(fā)現(xiàn)在腫瘤中形成一個(gè)mir-1246-dyrk1a-nfat信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用。目前在肝細(xì)胞肝癌中未見(jiàn)mir-1246的相關(guān)研究,本課題的研究目的是為了探討mir-1246在人類(lèi)肝細(xì)胞肝癌(hcc)中表達(dá)及其在肝細(xì)胞肝癌中發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用,以期尋找到hcc發(fā)病的新的分子機(jī)制,為hcc診斷或者治療的新策略提供理論依據(jù)。基于上述研究背景和提出的科學(xué)問(wèn)題,關(guān)于mir-1246在hcc細(xì)胞中的表達(dá)、生物學(xué)作用及分子作用機(jī)制,進(jìn)行了如下研究:以六株hcc細(xì)胞系huh7、c3a、plc、hepg2、hep3b、sun387和正常肝細(xì)胞系lo2以及50例hcc臨床樣本為研究對(duì)象,首先通過(guò)真核細(xì)胞過(guò)表達(dá)和rnai技術(shù)研究p53基因和mir-1246表達(dá)的關(guān)系,進(jìn)而采用實(shí)時(shí)定量pcr(qrt-pcr)檢測(cè)hcc細(xì)胞系和臨床樣本中p53基因和mir-1246表達(dá)量,并且分析二者表達(dá)的關(guān)系。選擇hcc細(xì)胞系hep3b和hepg2做為進(jìn)一步的細(xì)胞研究模型,通過(guò)分別在兩株細(xì)胞系中上調(diào)或者下調(diào)mir-1246表達(dá)量,檢測(cè)此microrna對(duì)細(xì)胞增殖、克隆形成能力及侵襲的影響�；诩�(xì)胞水平的研究,進(jìn)而通過(guò)建立裸鼠腫瘤模型,探討mir-1246在動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)作用。通過(guò)生物信息學(xué)及熒光報(bào)告基因?qū)ふ也Ⅱ?yàn)證mir-1246的作用靶點(diǎn)nfib(nuclearfactori/b),通過(guò)rnai技術(shù)、mtt、克隆形成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞凋亡檢測(cè)闡明其作用機(jī)制。通過(guò)westernblot、免疫組化、qrt-pcr技術(shù)檢測(cè)了50對(duì)hcc臨床樣本組織和血清中的p53、mir-1246、nfib的表達(dá),通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定在臨床hcc樣本中p53和mir-1246表達(dá)的相關(guān)性,mir-1246和nfib表達(dá)的相關(guān)性,以及hcc組織中mir-1246和血清中mir-1246表達(dá)的相關(guān)性,從而探討p53-mir-1246-nfib通路的臨床意義。本課題三部分的具體內(nèi)容如下:第一部分:hcc細(xì)胞中p53基因誘導(dǎo)mir-1246的表達(dá)及其生物學(xué)功能目的:1在hcc細(xì)胞系hepg2、c3a中,p53基因是否能夠誘導(dǎo)mir-1246的表達(dá)。2不同表達(dá)狀態(tài)p53基因的hcc細(xì)胞系hepg2,c3a,hep3b,plc,huh7,sun387及臨床hcc腫瘤組織中mir-1246表達(dá)情況。3體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討mir-1246對(duì)hcc細(xì)胞的增殖、克隆形成能力、細(xì)胞遷移能力及成瘤能力的影響。方法:1構(gòu)建pcdna3.1-p53真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒,使用脂質(zhì)體lipofectaminetm2000轉(zhuǎn)染兩株hcc細(xì)胞系hepg2和c3a,pcdna3.1空載質(zhì)粒作為對(duì)照;合成p53基因特異性的小干擾rna(sirna-p53),進(jìn)而使用interferin將此sirna轉(zhuǎn)染hepg2和c3a,應(yīng)用qrt-pcr技術(shù)檢測(cè)mir-1246的表達(dá)水平。2采用qrt-pcr技術(shù)在表達(dá)不同狀態(tài)的p53基因的六株細(xì)胞系中檢測(cè)mir-1246的表達(dá)水平,以及在高表達(dá)和低表達(dá)p53基因的hcc組織中檢測(cè)mir-1246的表達(dá)水平。3在hepg2和hep-3b細(xì)胞系中rna干擾或者過(guò)表達(dá)mir-1246,并采用mtt技術(shù)及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mir-1246對(duì)hepg2和hep-3b細(xì)胞的增殖和克隆形成能力的影響。4通過(guò)構(gòu)建shrna-mir-1246的表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染hepg2細(xì)胞篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)的克隆,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mir-1246對(duì)hepg2細(xì)胞遷移能力的影響;進(jìn)一步將穩(wěn)定表達(dá)mir-1246的hepg2細(xì)胞接種到balb/c裸鼠皮下,進(jìn)行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn),體內(nèi)觀察mir-1246對(duì)于腫瘤生成的影響。結(jié)果:1hcc細(xì)胞系hepg2和c3a中干擾p53基因后,mir-1246表達(dá)顯著下調(diào)(p0.05);過(guò)表達(dá)p53基因后,mir-1246表達(dá)顯著上調(diào)(p0.05)。2在表達(dá)不同狀態(tài)p53基因的hcc細(xì)胞系中,與表達(dá)野生型p53組比較,不表達(dá)p53組或者表達(dá)突變p53組,mir-1246的表達(dá)差異具有顯著性(p0.05),同時(shí)證明了在p53基因高表達(dá)的hcc臨床樣本組織中,mir-1246的量也相應(yīng)高水平表達(dá);反之,在p53基因低表達(dá)的hcc臨床樣本組織中,mir-1246的量也相應(yīng)低水平表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(p0.05)。3過(guò)表達(dá)mir-1246類(lèi)似物的hep3b細(xì)胞增殖和克隆形成能力受到顯著抑制(p0.05),轉(zhuǎn)染了mir-1246反義寡聚核苷酸后的hepg2細(xì)胞增殖和克隆形成能力顯著增強(qiáng)(p0.05)。4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了shrna-1246的hepg2細(xì)胞的劃痕修復(fù)能力顯著下降,說(shuō)明mir-1246具有抑制細(xì)胞遷移的能力。5進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),過(guò)表達(dá)shrna-1246hepg2細(xì)胞克隆在裸鼠中形成成瘤體重量顯著低于對(duì)照組的腫瘤重量(對(duì)照組腫瘤平均重量為0.56±0.10g,而實(shí)驗(yàn)組腫瘤的平均重量為0.32±0.07g,統(tǒng)計(jì)分析表明,兩組數(shù)據(jù)差異顯著(p0.05)。結(jié)論:1在hcc細(xì)胞系中p53能夠誘導(dǎo)mir-1246表達(dá),并且在hcc患者組織中p53mrna與mir-1246的表達(dá)水平具有一致性。2mir-1246具有調(diào)控hcc細(xì)胞增殖、細(xì)胞克隆和遷移能力的作用。3裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明mir-1246具有抑制hepg2細(xì)胞在裸鼠中的成瘤能力。4p53基因誘導(dǎo)的mir-1246具有抑制hcc發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)功能。第二部分:hcc細(xì)胞系中mir-1246靶向調(diào)控nfib的作用機(jī)制研究目的:1以六株hcc細(xì)胞系hepg2、c3a、hep3b、plc、huh7、sun387及正常肝細(xì)胞系lo2為研究對(duì)象,預(yù)測(cè)及尋找mir-1246直接作用靶基因。2探討mir-1246對(duì)靶基因nfib的影響及二者間的相關(guān)性。3在hcc細(xì)胞系中探討n(yōu)fib對(duì)細(xì)胞增殖、克隆形成及細(xì)胞凋亡的影響。方法:1通過(guò)miranda,pictarand和targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)分析,預(yù)測(cè)出nfib基因可能是mir-1246的作用靶點(diǎn),通過(guò)構(gòu)建包含nfib的3'utr及nfib的3'utr突變的熒光素酶報(bào)告基因,在hepg2細(xì)胞中通過(guò)共轉(zhuǎn)熒光素酶報(bào)告基因與mir-1246或者mir-1246aso探討mir-1246是否直接與nfib的3'utr結(jié)合。2通過(guò)在hepg2和hep3b細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染mir-1246和mir-1246aso及相應(yīng)的對(duì)照寡居核苷酸,應(yīng)用qrt-pcr和westernblot檢測(cè)nfib的mrna和蛋白質(zhì)水平的變化。3在hcc細(xì)胞系hepg2細(xì)胞中,通過(guò)采用sirna技術(shù)干擾nfib基因的表達(dá),采用mtt檢測(cè)技術(shù),克隆形成能力及凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)探討n(yōu)fib對(duì)hepg2細(xì)胞的增殖、克隆形成能力及凋亡的影響;共同過(guò)表達(dá)mir-1246和nfib基因、mir-1246、mir-對(duì)照,探討mir-1246靶向nfib發(fā)揮抑制腫瘤形成的作用。4通過(guò)westernblot技術(shù)檢測(cè)和qrt-pcr表達(dá)不同狀態(tài)的p53基因的六株hcc細(xì)胞系hepg2、c3a、hep3b、plc、huh7、sun387中nfib和mir-1246的表達(dá)水平,探討mir-1246的表達(dá)與nfib的蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果:1通過(guò)生物信息學(xué)分析及熒光報(bào)告基因檢測(cè)表明mir-1246能夠直接結(jié)合nfib的3'utr;2在改變hepg2和hep3b細(xì)胞中的mir-1246表達(dá)水平后,qrt-pcr實(shí)驗(yàn)表明mir-1246不影響抑制靶基因nfibmrna的表達(dá);在改變lo2、hepg2、c3a、hep3b、huh7、plc細(xì)胞中的mir-1246表達(dá)水平后westernblot實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)了nfib的蛋白的表達(dá)。3sirna-nfib抑制nfib基因的表達(dá)后,進(jìn)一步通過(guò)mtt,軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)(facs)凋亡檢測(cè)證實(shí)細(xì)胞增殖及克隆形成能力顯著受到抑制(p0.05);并且細(xì)胞的凋亡顯著增加(p0.05);共同過(guò)表達(dá)mir-1246和nfib基因、mir-1246、mir-對(duì)照證實(shí)mir-1246靶向nfib發(fā)揮抑制腫瘤形成的作用(p0.05);4p53不同表達(dá)狀態(tài)六株hcc細(xì)胞系hepg2、c3a、hep3b、plc、huh7、sun387中,表達(dá)野生型p53hcc細(xì)胞系hepg2、c3a中nfib蛋白顯著低于其他四種細(xì)胞系(p0.05),graphpad統(tǒng)計(jì)軟件分析證實(shí)了在hcc細(xì)胞系中nfib和mir-1246的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=-0.8940,p0.05)。結(jié)論:1mir-1246能夠通過(guò)與nfib的3'utr結(jié)合調(diào)控nfib的蛋白質(zhì)的表達(dá),沒(méi)有改變其mrna表達(dá)水平。2干擾nfib基因的表達(dá)能夠抑制hcc細(xì)胞hepg2的增殖,能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡;過(guò)表達(dá)nfib基因能夠逆轉(zhuǎn)mir-1246抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。3nfib蛋白與mir-1246的表達(dá)在hcc細(xì)胞系中呈負(fù)相關(guān),nfib基因是mir-1246的作用靶點(diǎn),說(shuō)明mir-1246是通過(guò)靶向nfib基因發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。4p53-mir-1246-nfib可能是hcc發(fā)生發(fā)展中新的信號(hào)通路。第三部分:p53-mir-1246-nfib通路在hcc中的臨床意義目的:以50例hcc患者臨床樣本癌組織、癌旁組織及血清為研究對(duì)象,檢測(cè)臨床樣本組織中p53、mir-1246、nfib的表達(dá)水平及分析其相關(guān)性,探討p53-mir-1246-nfib通路在hcc發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。方法:1采用westernblot和免疫組織化學(xué)(ihc)技術(shù)檢測(cè)p53和nfib蛋白質(zhì)在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平。2采用qrt-pcr檢測(cè)了肝癌組織和癌旁組織中的mir-1246的表達(dá)水平,探討在hcc患者樣本中mir-1246的表達(dá)與p53蛋白的表達(dá)、nfib蛋白表達(dá)的相關(guān)性。3通過(guò)qrt-pcr技術(shù)檢測(cè)了hcc患者的血清中mir-1246的表達(dá),探討血清中mir-1246的表達(dá)與hcc患者癌組織中mir-1246相關(guān)性,從而確定p53-mir-1246-nfib通路的臨床意義。結(jié)果:1westernblot檢測(cè)結(jié)合灰度掃描分析表明,p53蛋白在50例hcc患者癌組織樣本中顯著低于其在癌旁組織中的表達(dá)(p0.01);250例hcc癌組織中mir-1246表達(dá)水平顯著低于其在癌旁組織中的表達(dá)水平(p0.01);進(jìn)一步采用spss軟件相關(guān)性分析表明p53蛋白的高表達(dá)與miR-1246的高表達(dá)具有正相關(guān)(r=0.734,P0.001)。3免疫組織化學(xué)(IHC)結(jié)果顯示50例HCC癌旁組織中NFIB高表達(dá)率為24%(12/50),而HCC癌組織中NFIB表達(dá)的高表達(dá)率為54%(27/50),χ2檢驗(yàn)分析表明兩組樣本間NFIB表達(dá)具有顯著性差異(P0.01);SPSS軟件相關(guān)性分析表明miR-1246表達(dá)與NFIB蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.419,P=0.002)。4qRT-PCR檢測(cè)HCC患者血清中的miR-1246表達(dá)結(jié)果顯示30%(13/43)血清高表達(dá)mi R-1246,而70%(30/43)血清中低表達(dá)miR-1246,進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析表明血清中的miR-1246表達(dá)量與HCC癌組織中mi R-1246的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.323,P=0.035)。結(jié)論:1在癌旁組織中p53蛋白表達(dá)水平顯著高于其在HCC患者癌組織中的表達(dá);在癌旁組織中miR-1246表達(dá)水平顯著高于其在HCC患者癌組織中的表達(dá),p53蛋白表達(dá)與mi R-1246表達(dá)呈正相關(guān)。p53可能參與誘導(dǎo)調(diào)控miR-1246表達(dá)。2在癌旁組織中NFIB蛋白表達(dá)水平顯著低于其在HCC患者癌組織中的表達(dá),mi R-1246表達(dá)與NFIB蛋白表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),表明miR-1246可能參與負(fù)向調(diào)控NFIB蛋白表達(dá)。3 HCC患者血清中miR-1246表達(dá)水平與其在HCC患者癌組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān),表明HCC癌組織中的miR-1246能夠釋放到血清中,miR-1246在HCC診治方面具有重要的臨床意義。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Yi Lin Jane Tan;Wei Ning Chen;;MicroRNAs as therapeutic strategy for hepatitis B virusassociated hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects[J];World Journal of Gastroenterology;2014年20期

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本文編號(hào)：1594207