本文選題：微顆粒　切入點(diǎn)：溶瘤腺病毒　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：溶瘤病毒是一種經(jīng)過基因改造的病毒,可以特異性地在腫瘤細(xì)胞中大量復(fù)制并殺傷腫瘤細(xì)胞。利用溶瘤病毒治療惡性腫瘤是腫瘤生物療法的主要策略之一,目前已有多種病毒被改造成溶瘤病毒,并得到快速發(fā)展。然而,溶瘤病毒具有很強(qiáng)的免疫原性,容易被機(jī)體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)識別并中和,導(dǎo)致溶瘤病毒難以到達(dá)腫瘤部位殺傷腫瘤細(xì)胞。但現(xiàn)有的一些溶瘤病毒載體,比如具有趨瘤性的細(xì)胞或人工合成的納米材料,其效果并不理想,一些載體還存在著安全隱患。因此,亟待研發(fā)新型載體攜帶溶瘤病毒并靶向腫瘤細(xì)胞。我們課題組前期工作顯示腫瘤細(xì)胞來源的微顆粒(Tumor cell-derived microparticles, T-MPs) (直徑為100-1000 nm)可以包裹化療藥物并有效殺傷腫瘤細(xì)胞。而T-MPs是否能夠包裹溶瘤腺病毒,作為運(yùn)輸溶瘤腺病毒的新型載體則不清楚。因此,我們提出假設(shè)：T-MPs的直徑明顯大于溶瘤腺病毒的直徑(90～100nm),有可能成為包裹并運(yùn)輸溶瘤腺病毒的載體。為驗(yàn)證這一設(shè)想,本課題著重從以下三個(gè)方面進(jìn)行研究：首先,檢測T-MPs是否能夠包裹溶瘤腺病毒。選用人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞提取包裹溶瘤腺病毒的微顆粒OA-MPs (Oncolytic adenovirus contained microparticles, OA-MPs);利用透射電子顯微鏡分析單個(gè)OA-MP的形態(tài),以粒徑分布分析技術(shù)和流式分析技術(shù)檢測OA-MPs群體的直徑分布狀況,由此證實(shí)所提取的OA-MPs樣本符合微顆粒的質(zhì)量要求；再用PCR (Polymerase chain reaction, PCR)分析OA-MPs的成分,并采用雙光子顯微鏡技術(shù)對T-MPs與溶瘤腺病毒進(jìn)行共定位分析。結(jié)果證明OA-MPs可以包裹溶瘤腺病毒。其次,清除OA-MPs中游離的溶瘤腺病毒顆粒,對OA-MPs進(jìn)行純化后用于體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),檢測DA-MPS是否能有效殺傷腫瘤細(xì)胞。對于體外實(shí)驗(yàn),將OA-MPs與多種腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng),觀察腫瘤細(xì)胞生長變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比,OA-MPs組的腫瘤細(xì)胞凋亡增多；對于體內(nèi)實(shí)驗(yàn),通過建立裸鼠皮下、腹腔腫瘤模型,觀察并比較對照組、溶瘤腺病毒組以及OA-MPs組的腫瘤大小、腫瘤重量及小鼠長期存活率。結(jié)果顯示,與對照組和溶瘤腺病毒組相比,OA-MPs組的小鼠長期存活率明顯提高,其腫瘤生長受到明顯抑制。最后,為進(jìn)一步驗(yàn)證T-MPs是否可以躲避中和抗體,作為攜帶溶瘤腺病毒的有效載體,本課題通過PCR技術(shù)、流式檢測技術(shù)、電子顯微鏡技術(shù)、雙光子顯微鏡檢測技術(shù)、三維纖維蛋白軟凝膠篩選干細(xì)胞技術(shù),并建立動(dòng)物皮下腫瘤以及腹腔腫瘤模型,對OA-MPs組與溶瘤腺病毒組殺傷腫瘤細(xì)胞的效果進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與空白對照組及溶瘤腺病毒組相比,OA-MPs殺傷腫瘤細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：(1)OA-MPs可保護(hù)溶瘤腺病毒不被特異性中和抗體識別,并使溶瘤腺病毒有效殺傷腫瘤細(xì)胞；(2)OA-MPs可以介導(dǎo)其包裹的溶瘤腺病毒更快進(jìn)入細(xì)胞核,使溶瘤腺病毒更快殺傷腫瘤細(xì)胞；(3)OA-MPs不依賴柯薩奇病毒腺病毒受體(Coxsackievirus and adeno virus receptor, CAR)介導(dǎo)溶瘤腺病毒進(jìn)入細(xì)胞,因此對于CAR表達(dá)下調(diào)的腫瘤細(xì)胞依然具有殺傷作用；(4)OA-MPs能有效地抑制三維纖維蛋白軟凝膠篩選出來的干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的生長(Stem-like tumor-repopulating cells, TRC)。本研究利用T-MPs作為攜帶溶瘤腺病毒的載體,并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)檢測了T-MPs攜帶溶瘤腺病毒殺傷腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)與優(yōu)勢,為其潛在的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.5
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本文編號：1589435