本文選題：索拉非尼　切入點：miR-375　出處：《西南醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:利用miRNA芯片和qRT-PCR篩選和確認索拉非尼處理前后的肝癌細胞中差異性表達的miRNAs。初步探索上述差異表達miRNAs對肝癌新生血管生成的調(diào)控功能和潛在分子機制。方法:第一部分、索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細胞miR-375表達上調(diào)1.加入不同濃度的索拉非尼處理Hep3B、Hep G2 48h,明確索拉非尼對Hep3B、Hep G2的IC50;2.提取索拉非尼處理前后的肝癌細胞的RNA行miRNA芯片檢測分析,篩選差異表達的miRNAs;3.miRNA芯片篩選出miR-375等差異表達miRNAs的基礎(chǔ)上,利用qRT-PCR檢測不同濃度的索拉非尼處理前后肝癌細胞中miR-375的表達變化;第二部分、miR-375抑制肝癌新生血管生成的功能和機制研究1.利用qRT-PCR檢測臨床肝癌組織和癌旁組織中;肝癌細胞系Hep3B、Hep G2、Huh1、Huh7和正常肝細胞系LO2中miR-375的表達差異;2.利用過表達miR-375的慢病毒感染肝癌細胞,并用qRT-PCR確認miR-375在肝癌細胞中的過表達效率;3.利用CCK-8增殖實驗、克隆形成實驗、Transwell實驗、劃痕實驗、凋亡實驗檢測miR-375對肝癌細胞增殖、克隆形成、侵襲、遷移、凋亡的影響;4.利用HUVEC血管管腔形成實驗、大鼠主動脈環(huán)出芽實驗、雞胚絨毛尿素膜血管生成實驗在體外和體內(nèi)水平分別檢測miR-375對肝癌新生血管生成的影響;5.在生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-375的潛在下游靶基因PDGFC的基礎(chǔ)上,利用qRT-PCR、Western blotting、IHC檢測臨床肝癌組織和癌旁組織中PDGFC的表達差異;6.利用qRT-PCR、Western blotting檢測肝癌細胞系Hep3B、Hep G2、Huh1、Huh7和正常肝細胞系LO2中PDGFC的表達差異;利用慢病毒載體和miR-375的抑制物分別在肝癌細胞中過表達和下調(diào)表達miR-375,利用qRT-PCR、Western blotting和Elisa檢測PDGFC的表達變化,明確miR-375對PDGFC的調(diào)控功能;7.利用雙熒光素酶實驗明確miR-375對PDGFC調(diào)控的分子機制;8.在肝癌細胞過表達miR-375的同時外源性補充人重組PDGFCC蛋白和用RNAi實驗敲除PDGFC,利用HUVEC血管管腔形成、大鼠主動脈環(huán)出芽和雞胚絨毛膜尿素膜血管生成等“挽救實驗”明確miR-375是否通過直接調(diào)控PDGFC的表達抑制肝癌新生血管的生成;9.利用裸鼠成瘤實驗在整體動物水平檢測miR-375對裸鼠腫瘤生長、血管生成及生存時間的影響;10.在索拉非尼處理肝癌細胞的同時,采用miR-375的抑制物下調(diào)表達miR-375,利用qRT-PCR和Western blottng檢測PDGFC的表達變化;明確索拉非尼是否通過誘導(dǎo)miR-375表達上調(diào)抑制PDGFC的表達;第三部分、miR-375調(diào)控肝癌細胞PDGFC下游信號通路的初步研究利用Western blotting檢測過表達和下調(diào)表達miR-375后AKT,ERK1/2的磷酸化水平;結(jié)果:第一部分、索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細胞miR-375表達上調(diào)1.索拉非尼對Hep3B、Hep G2的IC50分別為2.77u M、3.28u M;2.miRNA芯片結(jié)果顯示:索拉非尼可誘導(dǎo)包括miR-375在內(nèi)的miRNAs表達上調(diào);3.qRT-PCR結(jié)果顯示:索拉非尼濃度依賴性誘導(dǎo)肝癌細胞miR-375表達上調(diào);第二部分、miR-375抑制肝癌新生血管生成的功能和機制研究1.qRT-PCR結(jié)果顯示:miR-375在臨床肝癌組織中的表達明顯低于癌旁組織,miR-375在肝癌細胞系Hep3B、Hep G2、Huh1、Huh7中的表達明顯低于正常肝細胞系LO2;2.慢病毒感染后見大量綠色熒光蛋白表達,qRT-PCR結(jié)果顯示:miR-375過表達成功;3.CCK-8增殖實驗和克隆形成實驗結(jié)果顯示:miR-375明顯抑制肝癌細胞的增殖能力和克隆形成能力;Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示:miR-375明顯抑制肝癌細胞的侵襲能力;Transwell遷移實驗、劃痕實驗結(jié)果顯示:miR-375明顯抑制肝癌細胞的遷移能力;凋亡實驗結(jié)果顯示:miR-375明顯促進肝癌細胞凋亡;4.HUVEC血管管腔形成實驗結(jié)果顯示:miR-375明顯抑制HUVEC血管管腔形成;大鼠主動脈環(huán)出芽實驗結(jié)果顯示:miR-375明顯抑制大鼠主動脈環(huán)的出芽及生長;雞胚絨毛尿素膜血管生成實驗結(jié)果顯示:miR-375明顯抑制雞胚絨毛尿素膜血管生成;5.生物信息學(xué)軟件targetscan 7.1預(yù)測PDGFC可能是miR-375的下游靶基因;qRT-PCR、Western blotting、IHC結(jié)果顯示:臨床肝癌組織中PDGFC的表達明顯高于癌旁組織;6.qRT-PCR、Western blotting結(jié)果顯示:肝癌細胞系Hep3B、Hep G2、Huh1、Huh7中PDGFC的表達明顯高于正常肝細胞系LO2;qRT-PCR、Western blotting、Elisa結(jié)果顯示:過表達miR-375后PDGFC的表達下降,抑制miR-375表達后PDGFC的表達升高;7.雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示:miR-375直接作用于PDGFC-3,UTR;8.HUVEC血管管腔形成、大鼠主動脈環(huán)出芽、雞胚絨毛膜尿素膜血管生成等“挽救實驗”和RNAi實驗顯示:miR-375直接通過調(diào)控PDGFC表達抑制肝癌新生血管生成;9.裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示:miR-375直接通過調(diào)控PDGFC表達抑制腫瘤生長、減少腫瘤血管的生成,明顯延長裸鼠的生存時間;10.qRT-PCR、Western blottng結(jié)果提示:索拉非尼通過誘導(dǎo)miR-375表達上調(diào)抑制PDGFC表達;第三部分、miR-375調(diào)控肝癌細胞PDGFC下游信號通路的初步研究Western blotting結(jié)果提示:過表達miR-375明顯抑制AKT、ERK1/2磷酸化;下調(diào)表達miR-375明顯促進AKT、ERK1/2磷酸化;結(jié)論:1.索拉非尼濃度依賴性誘導(dǎo)肝癌細胞miR-375上調(diào)表達。2.miR-375通過抑制PDGFC的表達抑制肝癌新生血管的生成。3.索拉非尼通過誘導(dǎo)miR-375表達上調(diào)抑制PDGFC的表達。4.miR-375抑制PDGFC下游信號通路Akt,ERK1/2的磷酸化激活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1587617