發(fā)布時(shí)間：2018-03-09 07:49

  本文選題：索拉非尼　切入點(diǎn)：miR-375　出處：《西南醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:利用miRNA芯片和qRT-PCR篩選和確認(rèn)索拉非尼處理前后的肝癌細(xì)胞中差異性表達(dá)的miRNAs。初步探索上述差異表達(dá)miRNAs對(duì)肝癌新生血管生成的調(diào)控功能和潛在分子機(jī)制。方法:第一部分、索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞miR-375表達(dá)上調(diào)1.加入不同濃度的索拉非尼處理Hep3B、Hep G2 48h,明確索拉非尼對(duì)Hep3B、Hep G2的IC50;2.提取索拉非尼處理前后的肝癌細(xì)胞的RNA行miRNA芯片檢測(cè)分析,篩選差異表達(dá)的miRNAs;3.miRNA芯片篩選出miR-375等差異表達(dá)miRNAs的基礎(chǔ)上,利用qRT-PCR檢測(cè)不同濃度的索拉非尼處理前后肝癌細(xì)胞中miR-375的表達(dá)變化;第二部分、miR-375抑制肝癌新生血管生成的功能和機(jī)制研究1.利用qRT-PCR檢測(cè)臨床肝癌組織和癌旁組織中;肝癌細(xì)胞系Hep3B、Hep G2、Huh1、Huh7和正常肝細(xì)胞系LO2中miR-375的表達(dá)差異;2.利用過(guò)表達(dá)miR-375的慢病毒感染肝癌細(xì)胞,并用qRT-PCR確認(rèn)miR-375在肝癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)效率;3.利用CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-375對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲、遷移、凋亡的影響;4.利用HUVEC血管管腔形成實(shí)驗(yàn)、大鼠主動(dòng)脈環(huán)出芽實(shí)驗(yàn)、雞胚絨毛尿素膜血管生成實(shí)驗(yàn)在體外和體內(nèi)水平分別檢測(cè)miR-375對(duì)肝癌新生血管生成的影響;5.在生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-375的潛在下游靶基因PDGFC的基礎(chǔ)上,利用qRT-PCR、Western blotting、IHC檢測(cè)臨床肝癌組織和癌旁組織中PDGFC的表達(dá)差異;6.利用qRT-PCR、Western blotting檢測(cè)肝癌細(xì)胞系Hep3B、Hep G2、Huh1、Huh7和正常肝細(xì)胞系LO2中PDGFC的表達(dá)差異;利用慢病毒載體和miR-375的抑制物分別在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)miR-375,利用qRT-PCR、Western blotting和Elisa檢測(cè)PDGFC的表達(dá)變化,明確miR-375對(duì)PDGFC的調(diào)控功能;7.利用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)明確miR-375對(duì)PDGFC調(diào)控的分子機(jī)制;8.在肝癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-375的同時(shí)外源性補(bǔ)充人重組PDGFCC蛋白和用RNAi實(shí)驗(yàn)敲除PDGFC,利用HUVEC血管管腔形成、大鼠主動(dòng)脈環(huán)出芽和雞胚絨毛膜尿素膜血管生成等“挽救實(shí)驗(yàn)”明確miR-375是否通過(guò)直接調(diào)控PDGFC的表達(dá)抑制肝癌新生血管的生成;9.利用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)在整體動(dòng)物水平檢測(cè)miR-375對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)、血管生成及生存時(shí)間的影響;10.在索拉非尼處理肝癌細(xì)胞的同時(shí),采用miR-375的抑制物下調(diào)表達(dá)miR-375,利用qRT-PCR和Western blottng檢測(cè)PDGFC的表達(dá)變化;明確索拉非尼是否通過(guò)誘導(dǎo)miR-375表達(dá)上調(diào)抑制PDGFC的表達(dá);第三部分、miR-375調(diào)控肝癌細(xì)胞PDGFC下游信號(hào)通路的初步研究利用Western blotting檢測(cè)過(guò)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)miR-375后AKT,ERK1/2的磷酸化水平;結(jié)果:第一部分、索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞miR-375表達(dá)上調(diào)1.索拉非尼對(duì)Hep3B、Hep G2的IC50分別為2.77u M、3.28u M;2.miRNA芯片結(jié)果顯示:索拉非尼可誘導(dǎo)包括miR-375在內(nèi)的miRNAs表達(dá)上調(diào);3.qRT-PCR結(jié)果顯示:索拉非尼濃度依賴(lài)性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞miR-375表達(dá)上調(diào);第二部分、miR-375抑制肝癌新生血管生成的功能和機(jī)制研究1.qRT-PCR結(jié)果顯示:miR-375在臨床肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織,miR-375在肝癌細(xì)胞系Hep3B、Hep G2、Huh1、Huh7中的表達(dá)明顯低于正常肝細(xì)胞系LO2;2.慢病毒感染后見(jiàn)大量綠色熒光蛋白表達(dá),qRT-PCR結(jié)果顯示:miR-375過(guò)表達(dá)成功;3.CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-375明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-375明顯抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力;Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-375明顯抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力;凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-375明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡;4.HUVEC血管管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-375明顯抑制HUVEC血管管腔形成;大鼠主動(dòng)脈環(huán)出芽實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-375明顯抑制大鼠主動(dòng)脈環(huán)的出芽及生長(zhǎng);雞胚絨毛尿素膜血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-375明顯抑制雞胚絨毛尿素膜血管生成;5.生物信息學(xué)軟件targetscan 7.1預(yù)測(cè)PDGFC可能是miR-375的下游靶基因;qRT-PCR、Western blotting、IHC結(jié)果顯示:臨床肝癌組織中PDGFC的表達(dá)明顯高于癌旁組織;6.qRT-PCR、Western blotting結(jié)果顯示:肝癌細(xì)胞系Hep3B、Hep G2、Huh1、Huh7中PDGFC的表達(dá)明顯高于正常肝細(xì)胞系LO2;qRT-PCR、Western blotting、Elisa結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)miR-375后PDGFC的表達(dá)下降,抑制miR-375表達(dá)后PDGFC的表達(dá)升高;7.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-375直接作用于PDGFC-3,UTR;8.HUVEC血管管腔形成、大鼠主動(dòng)脈環(huán)出芽、雞胚絨毛膜尿素膜血管生成等“挽救實(shí)驗(yàn)”和RNAi實(shí)驗(yàn)顯示:miR-375直接通過(guò)調(diào)控PDGFC表達(dá)抑制肝癌新生血管生成;9.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-375直接通過(guò)調(diào)控PDGFC表達(dá)抑制腫瘤生長(zhǎng)、減少腫瘤血管的生成,明顯延長(zhǎng)裸鼠的生存時(shí)間;10.qRT-PCR、Western blottng結(jié)果提示:索拉非尼通過(guò)誘導(dǎo)miR-375表達(dá)上調(diào)抑制PDGFC表達(dá);第三部分、miR-375調(diào)控肝癌細(xì)胞PDGFC下游信號(hào)通路的初步研究Western blotting結(jié)果提示:過(guò)表達(dá)miR-375明顯抑制AKT、ERK1/2磷酸化;下調(diào)表達(dá)miR-375明顯促進(jìn)AKT、ERK1/2磷酸化;結(jié)論:1.索拉非尼濃度依賴(lài)性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞miR-375上調(diào)表達(dá)。2.miR-375通過(guò)抑制PDGFC的表達(dá)抑制肝癌新生血管的生成。3.索拉非尼通過(guò)誘導(dǎo)miR-375表達(dá)上調(diào)抑制PDGFC的表達(dá)。4.miR-375抑制PDGFC下游信號(hào)通路Akt,ERK1/2的磷酸化激活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1587617