本文選題：miR-224　切入點：mTOR　出處：《吉林大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：胃癌是源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤,是最常見的消化道惡性腫瘤之一,臨床預后差,病死率高。進一步深入研究促進胃癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制,對尋找更加有效的胃癌治療策略有重要意義。本實驗以人胃癌組織標本、胃癌細胞系和裸鼠成瘤模型為研究對象,目的研究miR-224在胃癌中的表達、對胃癌細胞生物學行為的影響以及相關的分子機制。本實驗共分3部分:1.miR-224在胃癌組織及胃癌細胞系中的表達及臨床意義Micro RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子,在真核生物基因表達調(diào)控中起到非常重要的作用。研究顯示,胃癌組織中一些miRNA表達異常,參與胃癌生長和轉(zhuǎn)移等病理學進程。本研究收集了2010年1月至2012年12月胃癌手術患者切除的胃癌組織和癌旁組織,經(jīng)Deep sequencing檢測兩者中差異表達的miRNA。結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,胃癌組織中有30種miRNA(如miR-188、miR-490等)表達下調(diào),32種miRNA(如miR-224、miR-212等)表達上調(diào)。其中,胃癌組織中miR-224表達水平升高最為顯著。QRT-PCR結(jié)果同樣證實胃癌組織中miR-224的表達水平顯著高于癌旁組織(P0.01)。進一步檢測發(fā)現(xiàn),5種胃癌細胞系(HS-746T、MKN-45、HGC-27、SNU-5和BGC-823)中miR-224的表達水平明顯高于正常細胞系細胞(GES-1)(P0.001)。為明確miR-224表達異常的臨床意義,我們對患者臨床資料進一步分析,結(jié)果顯示胃癌組織中miR-224表達與胃癌患者腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(P0.05),并且miR-224高表達胃癌患者生存期較miR-224低表達患者生存期明顯縮短。本結(jié)果提示miR-224在胃癌組織中的表達高于癌旁組織,可作為胃癌病情進展的生物學標志物,其表達增高提示胃癌預后不良。2.miR-224促進胃癌細胞的增殖抑制胃癌細胞凋亡第一部分研究結(jié)果表明,miR-224在胃癌中高表達并提示預后不良,但miR-224對胃癌細胞生物學行為的影響尚無明確報道。因此,本部分研究進一步探討miR-224在胃癌細胞(HS-746T和BGC-823)增殖、轉(zhuǎn)移和抗凋亡中的作用。通過CCK8檢測miR-224對胃癌細胞增殖活性的影響,結(jié)果顯示,與對照組相比用miR-224 inhibitor處理的胃癌細胞增殖能力減弱(p0.05),而轉(zhuǎn)染miR-224(miR-224 mimics)的胃癌細胞增殖能力增強(p0.05)。流式細胞術檢測細胞周期發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-224抑制劑(miR-224 inhibitors)可使處于G1期的胃癌細胞比重增多,S期細胞減少(p0.05),并且誘導胃癌細胞凋亡增加(p0.01)。并且,通過Western blot和QRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),在miR-224 inhibitor處理的胃癌細胞中周期相關蛋白PCNA、Cyclin-D1和Cyclin-D2表達下調(diào),細胞周期抑制蛋白P21和P27表達上調(diào)(P0.05)。免疫熒光檢測同樣顯示,轉(zhuǎn)染miR-224 inhibitor可減弱胃癌細胞中Cyclin-D1和CDK4的表達。將未處理和轉(zhuǎn)染miR-224的HS-746T細胞分別接種至裸鼠皮下構(gòu)建裸鼠荷瘤模型,可觀察到與對照組相比接種miR-224低表達胃癌細胞的裸鼠腫瘤生長速度變慢(p0.001),平均重量體積更小(p0.001)。本部分研究結(jié)果表明,miR-224可促進胃癌細胞的增殖和抗凋亡能力,并促進在體胃癌組織的生長,抑制miR-224表達可作為胃癌治療的潛在手段。3.miR-224通過靶向m TOR促進胃癌的增殖轉(zhuǎn)移能力以及抗凋亡能力為解釋miR-224促腫瘤分子機制,我們通過生物信息學方法搜索miR-224的潛在作用靶點,發(fā)現(xiàn)細胞凋亡和增殖的關鍵調(diào)控蛋白m TOR的3’UTR端有miR-224的結(jié)合位點。熒光素酶報告實驗證實,miR-224可與該位點結(jié)合后調(diào)控熒光素酶的表達。通過Western blot和QRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-224 mimics的胃癌細胞(HS-746T和BGC-823)中m TOR m RNA和蛋白表達增加(p0.05),而用miR-224 inhibitors處理后的胃癌細胞中m TOR表達減少(p0.05)。Transwell實驗和細胞集落實驗結(jié)果顯示,miR-224可促進胃癌細胞遷移、侵襲和體外成集落,miR-224 inhibitor處理或敲除m TOR可使胃癌細胞的遷移、侵襲與集落形成能力明顯減弱。通過Western blot和QRT-PCR檢測m TOR相關的凋亡信號發(fā)現(xiàn),miR-224 inhibitor可使m TOR和Bcl2表達減弱,而Bax和Caspase 3/9的表達增強。免疫熒光染色結(jié)果也顯示,miR-224和miR-224 inhibitor分別上調(diào)和下調(diào)m TOR和Caspase 3在胃癌細胞中的表達。對荷瘤裸鼠的腫瘤組織進行免疫組化染色可知,miR-224 inhibitor可使腫瘤組織Tunel染色陽性細胞增多,Ki67陽性細胞數(shù)減少。Western blot結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染miR-224 inhibitor可下調(diào)腫瘤組織中m TOR、Bcl2、PCNA、Cyclin-D1和Cyclin-D2的表達,上調(diào)Bax、Caspase 3/9、P21和P27的表達。以上結(jié)果表明m TOR是miR-224的直接作用靶點,miR-224通過調(diào)控m TOR促進抗凋亡和促細胞增殖的蛋白表達增加,并抑制促凋亡蛋白的表達下調(diào),從而促進胃癌的生長、轉(zhuǎn)移和抗凋亡能力。miR-224/m TOR信號軸可作為新型藥物的作用靶點,有望為胃癌臨床精準化治療提供一條新途徑。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：1583621