本文選題：miR-224　切入點(diǎn)：mTOR　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：胃癌是源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,臨床預(yù)后差,病死率高。進(jìn)一步深入研究促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制,對(duì)尋找更加有效的胃癌治療策略有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以人胃癌組織標(biāo)本、胃癌細(xì)胞系和裸鼠成瘤模型為研究對(duì)象,目的研究miR-224在胃癌中的表達(dá)、對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及相關(guān)的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)共分3部分:1.miR-224在胃癌組織及胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)及臨床意義Micro RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子,在真核生物基因表達(dá)調(diào)控中起到非常重要的作用。研究顯示,胃癌組織中一些miRNA表達(dá)異常,參與胃癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等病理學(xué)進(jìn)程。本研究收集了2010年1月至2012年12月胃癌手術(shù)患者切除的胃癌組織和癌旁組織,經(jīng)Deep sequencing檢測(cè)兩者中差異表達(dá)的miRNA。結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,胃癌組織中有30種miRNA(如miR-188、miR-490等)表達(dá)下調(diào),32種miRNA(如miR-224、miR-212等)表達(dá)上調(diào)。其中,胃癌組織中miR-224表達(dá)水平升高最為顯著。QRT-PCR結(jié)果同樣證實(shí)胃癌組織中miR-224的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P0.01)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn),5種胃癌細(xì)胞系(HS-746T、MKN-45、HGC-27、SNU-5和BGC-823)中miR-224的表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞系細(xì)胞(GES-1)(P0.001)。為明確miR-224表達(dá)異常的臨床意義,我們對(duì)患者臨床資料進(jìn)一步分析,結(jié)果顯示胃癌組織中miR-224表達(dá)與胃癌患者腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P0.05),并且miR-224高表達(dá)胃癌患者生存期較miR-224低表達(dá)患者生存期明顯縮短。本結(jié)果提示miR-224在胃癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織,可作為胃癌病情進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物,其表達(dá)增高提示胃癌預(yù)后不良。2.miR-224促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖抑制胃癌細(xì)胞凋亡第一部分研究結(jié)果表明,miR-224在胃癌中高表達(dá)并提示預(yù)后不良,但miR-224對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚無(wú)明確報(bào)道。因此,本部分研究進(jìn)一步探討miR-224在胃癌細(xì)胞(HS-746T和BGC-823)增殖、轉(zhuǎn)移和抗凋亡中的作用。通過(guò)CCK8檢測(cè)miR-224對(duì)胃癌細(xì)胞增殖活性的影響,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比用miR-224 inhibitor處理的胃癌細(xì)胞增殖能力減弱(p0.05),而轉(zhuǎn)染miR-224(miR-224 mimics)的胃癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(p0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-224抑制劑(miR-224 inhibitors)可使處于G1期的胃癌細(xì)胞比重增多,S期細(xì)胞減少(p0.05),并且誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡增加(p0.01)。并且,通過(guò)Western blot和QRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在miR-224 inhibitor處理的胃癌細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白PCNA、Cyclin-D1和Cyclin-D2表達(dá)下調(diào),細(xì)胞周期抑制蛋白P21和P27表達(dá)上調(diào)(P0.05)。免疫熒光檢測(cè)同樣顯示,轉(zhuǎn)染miR-224 inhibitor可減弱胃癌細(xì)胞中Cyclin-D1和CDK4的表達(dá)。將未處理和轉(zhuǎn)染miR-224的HS-746T細(xì)胞分別接種至裸鼠皮下構(gòu)建裸鼠荷瘤模型,可觀察到與對(duì)照組相比接種miR-224低表達(dá)胃癌細(xì)胞的裸鼠腫瘤生長(zhǎng)速度變慢(p0.001),平均重量體積更小(p0.001)。本部分研究結(jié)果表明,miR-224可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力,并促進(jìn)在體胃癌組織的生長(zhǎng),抑制miR-224表達(dá)可作為胃癌治療的潛在手段。3.miR-224通過(guò)靶向m TOR促進(jìn)胃癌的增殖轉(zhuǎn)移能力以及抗凋亡能力為解釋miR-224促腫瘤分子機(jī)制,我們通過(guò)生物信息學(xué)方法搜索miR-224的潛在作用靶點(diǎn),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡和增殖的關(guān)鍵調(diào)控蛋白m TOR的3’UTR端有miR-224的結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí),miR-224可與該位點(diǎn)結(jié)合后調(diào)控?zé)晒馑孛傅谋磉_(dá)。通過(guò)Western blot和QRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-224 mimics的胃癌細(xì)胞(HS-746T和BGC-823)中m TOR m RNA和蛋白表達(dá)增加(p0.05),而用miR-224 inhibitors處理后的胃癌細(xì)胞中m TOR表達(dá)減少(p0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-224可促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲和體外成集落,miR-224 inhibitor處理或敲除m TOR可使胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲與集落形成能力明顯減弱。通過(guò)Western blot和QRT-PCR檢測(cè)m TOR相關(guān)的凋亡信號(hào)發(fā)現(xiàn),miR-224 inhibitor可使m TOR和Bcl2表達(dá)減弱,而Bax和Caspase 3/9的表達(dá)增強(qiáng)。免疫熒光染色結(jié)果也顯示,miR-224和miR-224 inhibitor分別上調(diào)和下調(diào)m TOR和Caspase 3在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。對(duì)荷瘤裸鼠的腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色可知,miR-224 inhibitor可使腫瘤組織Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞增多,Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少。Western blot結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染miR-224 inhibitor可下調(diào)腫瘤組織中m TOR、Bcl2、PCNA、Cyclin-D1和Cyclin-D2的表達(dá),上調(diào)Bax、Caspase 3/9、P21和P27的表達(dá)。以上結(jié)果表明m TOR是miR-224的直接作用靶點(diǎn),miR-224通過(guò)調(diào)控m TOR促進(jìn)抗凋亡和促細(xì)胞增殖的蛋白表達(dá)增加,并抑制促凋亡蛋白的表達(dá)下調(diào),從而促進(jìn)胃癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和抗凋亡能力。miR-224/m TOR信號(hào)軸可作為新型藥物的作用靶點(diǎn),有望為胃癌臨床精準(zhǔn)化治療提供一條新途徑。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：1583621