本文選題：細(xì)胞膜熒光染料　切入點(diǎn)：DiO　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的腫瘤異質(zhì)性一直是腫瘤治療中存在的重要挑戰(zhàn),同一腫瘤中可以存在許多不同基因型或亞型的細(xì)胞,在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移以及對治療的敏感性等方面產(chǎn)生差異。關(guān)于腫瘤異質(zhì)性產(chǎn)生的機(jī)制,得到多數(shù)人認(rèn)可的主要是克隆進(jìn)化學(xué)說和腫瘤干細(xì)胞學(xué)說。越來越多的證據(jù)表明,只有一小部分細(xì)胞負(fù)責(zé)腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移和對化療耐藥,這部分細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)。腫瘤干細(xì)胞具有無限自我更新并分化成多種類型細(xì)胞的能力。因此,區(qū)別和分離腫瘤干細(xì)胞在腫瘤治療中顯得尤為重要。為了研究具有不同增殖和分化能力的腫瘤干細(xì)胞,我們首先要優(yōu)化檢測細(xì)胞增殖的方法。測定體內(nèi)外細(xì)胞增殖的方法有很多,但這些方法無疑只能檢測較窄時(shí)間窗內(nèi)體外培養(yǎng)細(xì)胞的分裂,或追蹤最近分裂的細(xì)胞,且無法對活細(xì)胞做進(jìn)一步的分子生物學(xué)分析,更不能定量檢測不同細(xì)胞亞群的增殖情況。傳統(tǒng)的常用檢測細(xì)胞增殖的方法包括5-溴-2脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)染色、溴化噻唑藍(lán)四氮唑(MTT)試驗(yàn)、熒光染料標(biāo)記測定(CFSE、PKH)等。BrdU是一種嘧啶核苷酸類似物,其檢測原理是BrdU能在細(xì)胞周期的S期滲透進(jìn)DNA中,再利用BrdU抗體與DNA中的BrdU特異性結(jié)合,即可檢測到DNA復(fù)制活躍的細(xì)胞,這是通過直接測定細(xì)胞中的DNA來檢測細(xì)胞增殖,是最準(zhǔn)確的方法,但這種測定方法需要細(xì)胞樣品經(jīng)歷酸解、熱解、酶解等使DNA變性的過程,細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和活性遭到嚴(yán)重的破壞,以致難以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。此外,即便是高濃度的BrdU也只能追蹤檢測三個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)的分裂情況。另有研究表明經(jīng)BrdU標(biāo)記后,細(xì)胞生長停滯在G2期,且經(jīng)NP4處理后的細(xì)胞不能恢復(fù)細(xì)胞活性。有報(bào)道指出,在體外培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞及干細(xì)胞中,低劑量、單脈沖的BrdU亦表現(xiàn)出明顯的抗增殖作用以及對細(xì)胞特性和細(xì)胞活性的影響。另外一個(gè)檢測體外細(xì)胞增殖的方法是MTT試驗(yàn)。MTT法是通過細(xì)胞代謝來檢測細(xì)胞增殖。MTT是一種黃色染料,活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⒋┩高M(jìn)細(xì)胞膜中的MTT還原成不溶于水的藍(lán)紫色甲躦結(jié)晶,藍(lán)紫色結(jié)晶經(jīng)DMSO溶解后,在酶標(biāo)儀上測定OD490nm處的吸光度值,結(jié)晶的吸光度值與活細(xì)胞數(shù)量成正比。MTT試驗(yàn)己廣泛用在檢測藥物對細(xì)胞的毒性和生長抑制性,然而這個(gè)方法測定的只是活細(xì)胞的相對數(shù)量而不是絕對數(shù)量,而且同樣的,細(xì)胞經(jīng)MTT代謝后無法保存活性。熒光染料5(6)-羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)目前已廣泛應(yīng)用于示蹤體內(nèi)外細(xì)胞的分裂、轉(zhuǎn)移和定位。CFSE可與胞內(nèi)蛋白不可逆結(jié)合,并隨著每一次細(xì)胞分裂CFSE標(biāo)記的熒光平均分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中。CFSE標(biāo)記的細(xì)胞在熒光衰減至接近自發(fā)熒光前可被檢測到多達(dá)8次的細(xì)胞分裂,在體內(nèi)標(biāo)記中,也可觀察長達(dá)數(shù)周時(shí)間。然后,CFSE標(biāo)記的其中一個(gè)弊端是,CFSE在一定程度上有細(xì)胞毒性且抑制細(xì)胞增殖,雖然降低CFSE濃度能盡量避免其細(xì)胞毒性,然而卻會(huì)減少其可檢測的細(xì)胞分裂次數(shù)。在一些研究中,PKH26熒光染料標(biāo)記被用來分離惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌和卵巢癌中的靜止細(xì)胞,他們用PKH26高表達(dá)、低表達(dá)和不表達(dá)來描述分選出的細(xì)胞的不同特性,然而這個(gè)描述是主觀界定的。PKH26的標(biāo)記過程中需要添加多種反應(yīng)試劑及經(jīng)歷多次洗滌,相當(dāng)復(fù)雜和費(fèi)時(shí)。雖然PKH26可以示蹤體內(nèi)和體外細(xì)胞的增殖,但在冰凍切片和特殊爬片技術(shù)中的使用卻受到限制。在本研究中,我們描述了一種利用細(xì)胞膜熒光染料DiO/DiD來示蹤腫瘤細(xì)胞并定量檢測體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞分裂次數(shù)的新方法。DiO/DiD屬于長鏈羰花青熒光染料,是一種親脂性膜染料,它在水溶液中熒光極弱,然而當(dāng)用稀釋的染液標(biāo)記細(xì)胞時(shí),DiO/DiD中的烷基鏈嵌入細(xì)胞膜的磷脂雙份子層中,并激發(fā)出強(qiáng)烈的綠色／紅色熒光。用于示蹤細(xì)胞增殖時(shí),隨著細(xì)胞的每一次分裂,膜染料DiO/DiD的熒光能準(zhǔn)確地平分到兩個(gè)子代細(xì)胞上。DiO/DiD染料具有低熒光變異性、良好的標(biāo)記穩(wěn)定性、低細(xì)胞毒性以及極少發(fā)生細(xì)胞間轉(zhuǎn)移這些優(yōu)點(diǎn),此外,DiO/DiD并不影響標(biāo)記細(xì)胞及后代細(xì)胞的增殖,并能通過建立細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測體內(nèi)外細(xì)胞分裂情況。鑒于DiO/DiD染料的這些特性,本課題組探究了DiO/DiD標(biāo)記體內(nèi)外培養(yǎng)細(xì)胞的可行性,檢測了DiO/DiD標(biāo)記細(xì)胞的分群情況,并結(jié)合CD133抗原分子的表達(dá)分析腫瘤細(xì)胞耐藥性。利用本文中建立的DiO/DiD標(biāo)記腫瘤細(xì)胞定量檢測細(xì)胞增殖的方法,我們還探究了肝脂肪酶(hepatic lipase)及CD133在HepG2肝癌細(xì)胞化療耐藥中的作用。在本課題組的前期研究中,針對肝脂肪酶(LIPC)基因構(gòu)建EGFP-shRNA干擾慢病毒載體,轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并篩選穩(wěn)定表達(dá)株,發(fā)現(xiàn)下調(diào)LIPC后HepG2細(xì)胞增殖顯著減慢,克隆形成顯著減少,且CD133陽性細(xì)胞百分比亦顯著下降,對阿霉素、5-fu化療產(chǎn)生抵抗。本研究利用DiO/DiD標(biāo)記細(xì)胞的方法進(jìn)一步探討LIPC、CD 133與腫瘤細(xì)胞增殖和化療的關(guān)系。研究方法1.細(xì)胞膜熒光染料DiO/DiD的研究,包括其細(xì)胞毒性及標(biāo)記穩(wěn)定性。1.1 MTT法檢測細(xì)胞膜熒光染料染色后細(xì)胞的增殖。分別檢測Lovo細(xì)胞、SW480細(xì)胞、SW620細(xì)胞、CT26細(xì)胞以及HepG2細(xì)胞的增殖情況。1.2流式細(xì)胞術(shù)檢測DiO/DiD標(biāo)記的穩(wěn)定性。1.2.1體外培養(yǎng)：將DiO標(biāo)記的人HepG2細(xì)胞與未標(biāo)記的小鼠CT26細(xì)胞以1：1的比例共培養(yǎng)1周,然后用Percp-EPCAM抗人抗體染色后,上流式細(xì)胞儀檢測。該方法原理：EPCAM抗體為抗人抗體,因此HepG2細(xì)胞高表達(dá)EPCAM,而CT26為小鼠細(xì)胞,不表達(dá)EPCAM,因此利用EPCAM和DiO/DiD雙染色可以檢測細(xì)胞膜染料在細(xì)胞之間是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。1.2.2體內(nèi)培養(yǎng)：收集DiD標(biāo)記的HepG2單細(xì)胞懸液并注射到BALB/c小鼠肝被膜下,并以未標(biāo)記DiD的HepG2細(xì)胞作為陰性對照,8天后分離肝內(nèi)腫瘤并制得單細(xì)胞懸液,染Percp-EPCAM抗人抗體后流式檢測。2.建立定量檢測體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞增殖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.1方法原理：研究表明DiO染料的熒光強(qiáng)度在一定時(shí)間內(nèi)(≤15天)并沒有發(fā)生衰減,DiO標(biāo)記細(xì)胞后隨著細(xì)胞的每一次分裂,熒光平均分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中,因此我們可以推斷出：當(dāng)M為細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度,N為細(xì)胞數(shù)目,S為細(xì)胞分裂次數(shù),可有以下公式成立：M初*N初=M末*N末,log2M初/M未=S=1og2N末/N初,即S=log2M初-log2M末。由于M初為一可檢測固定值,因此可應(yīng)用R軟件對S和M末進(jìn)行對數(shù)曲線擬合,建立細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2不同血清濃度培養(yǎng)下細(xì)胞增殖分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線。將DiO標(biāo)記的細(xì)胞后以合適密度鋪于六孔板中,用含不同血清濃度(10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%)的培養(yǎng)基培養(yǎng)至80%～90%匯合度后,收集細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),流式檢測每孔細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。應(yīng)用R軟件、Excel建立細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值與細(xì)胞分裂次數(shù)之間的對數(shù)擬合公式和擬合曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分裂曲線公式,可通過檢測DiO標(biāo)記后的熒光強(qiáng)度計(jì)算活細(xì)胞亞群的分裂次數(shù)。2.3不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞增殖分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線。DiO標(biāo)記的CT26細(xì)胞和HepG2細(xì)胞以適當(dāng)密度N1培養(yǎng)于六孔板中,當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80～90%時(shí),收集細(xì)胞,取1/5細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),剩余4/5細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)記為N,并測定其平均熒光強(qiáng)度值M末。重復(fù)以上步驟直到細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度衰減至與DiO自發(fā)熒光接近。假設(shè)細(xì)胞標(biāo)記培養(yǎng)后不進(jìn)行收集檢測,則每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的細(xì)胞總數(shù)目N。可由以下公式計(jì)算得到：Nn= (5N/4)×5n-1(n為細(xì)胞的收集次數(shù))。細(xì)胞分裂次數(shù)S=log2M初/M末=log2Nn/N1,應(yīng)用R軟件、Excel建立細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值與細(xì)胞分裂次數(shù)之間的對數(shù)擬合公式和擬合曲線。3.DiO標(biāo)記方法的體內(nèi)外應(yīng)用研究。3.1 DiO標(biāo)記腫瘤細(xì)胞在化療后的作用。DiO標(biāo)記的HepG2細(xì)胞分別用不同濃度的阿霉素(0.1μM、0.3μM)化療10天后行流式檢測,發(fā)現(xiàn)化療后的HepG2細(xì)胞根據(jù)DiO熒光強(qiáng)度強(qiáng)弱分為兩細(xì)胞亞群,分別是DiO-Low和DiO-High細(xì)胞亞群。對細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞標(biāo)志物CD133表達(dá)分析,探究CD133與腫瘤化療的關(guān)系。3.2 DiO標(biāo)記用于腫瘤細(xì)胞亞群分選。用流式細(xì)胞分選技術(shù)對DiO-Low和DiO-High兩個(gè)細(xì)胞亞群進(jìn)行分選,分選后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,3天后分別提取核糖體-新生肽鏈復(fù)合物中的mRNA (RNC-mRNA)。RNC-mRNA被認(rèn)為與蛋白質(zhì)豐度有更好的相關(guān)性,因此我們認(rèn)為提取RNC-mRNA進(jìn)行基因芯片分析有更可信的價(jià)值。用100μg/mL環(huán)己酰亞胺預(yù)處理細(xì)胞15min,37℃孵育,然后轉(zhuǎn)移至冰上,用預(yù)冷的PBS沖洗兩遍,完全吸凈PBS溶液,加入1ml細(xì)胞裂解液,冰浴30min,刮取裂解細(xì)胞產(chǎn)物,轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5mlEP管中。16000*g, 10min,4℃離心,除去細(xì)胞碎片,將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至蔗糖溶液中。在超離心管(9ml)中加入8ml預(yù)冷30%蔗糖溶液(用RB buffer溶解),吸取1ml離心上清液緩慢沿管壁加到蔗糖溶液表面,安裝預(yù)冷的離心管和轉(zhuǎn)子適配器,超速離心(Beckman Coulter L-80XP),330000*g,3h,4℃。整個(gè)過程確保在4℃進(jìn)行以避免RNC-mRNA的降解。離心后,可看到管底透明膠狀物,小心把上清吸掉,用100-200ml Rb buffer充分重懸分離產(chǎn)物,加入1ml Trizol,輕輕吹打混勻。然后常規(guī)提取RNA,并RNA電泳和分光光度計(jì)上檢測RNA濃度。3.3 cDNA表達(dá)譜芯片分析。所使用芯片為RiboArrayTMgenDETECTTMHuman Array 1×40k(廣州銳博生物公司),重復(fù)探針3個(gè)。分別提取DiO-Low和DiO-High細(xì)胞的RNC-mRNA,并常規(guī)提取RNA,重復(fù)三次,將所得總RNA混勻,用Narodrop、瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2200 Bioanalyzer進(jìn)行RNA質(zhì)檢。取250ng的總RNA合成cDNA并進(jìn)行CyDye-ULS標(biāo)記,按照芯片說明書的方法進(jìn)行芯片雜交,用GenePix 4000B掃描芯片及提取原始數(shù)據(jù),進(jìn)行生物信息學(xué)分析。3.4分析早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞中DiO熒光強(qiáng)度與細(xì)胞分裂次數(shù)之間的關(guān)系。用20μM阿霉素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡后,收集細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色后細(xì)胞計(jì)數(shù),然后用Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況,并分析早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的DiO熒光強(qiáng)度和細(xì)胞分裂次數(shù)之間的關(guān)系。3.5 DiO標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長及定量分析。3.5.1 DiO標(biāo)記的CT26細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠皮下,分別在第3天、第9天、第14天分離皮下瘤制得單細(xì)胞懸液,流式檢測細(xì)胞平均DiO熒光強(qiáng)度。根據(jù)CT26細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線,可計(jì)算細(xì)胞分裂次數(shù)。3.5.2 DiO標(biāo)記的CT26細(xì)胞分別注射到BALB/c裸鼠皮下、脾被膜下,并于3天后分離皮下原位瘤、脾臟原位瘤、肝臟轉(zhuǎn)移瘤,制得單細(xì)胞懸液,流式測定細(xì)胞平均DiO熒光強(qiáng)度。根據(jù)CT26細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線,可計(jì)算細(xì)胞分裂次數(shù)。比較腫瘤細(xì)胞在皮下、脾臟、肝臟的增殖速度。3.5.3 DiO標(biāo)記的CT26細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠的肝被膜下,分別在第3、4、5、9、10天分裂肝臟原位瘤以及其他肝葉的轉(zhuǎn)移瘤,制得單細(xì)胞懸液,流式測定細(xì)胞平均DiO熒光強(qiáng)度。根據(jù)CT26細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線,可計(jì)算細(xì)胞分裂次數(shù)。比較腫瘤細(xì)胞在同一個(gè)器官中的原位瘤及轉(zhuǎn)移瘤的增殖速度。4.DiD標(biāo)記用于檢測肝脂肪酶在HepG2腫瘤細(xì)胞耐藥中的作用。4.]用攜帶EGFP報(bào)告基因的LIPC shRNA干擾慢病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞株,不做穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選,常規(guī)培養(yǎng)。(未經(jīng)篩選的HepG2-shLIPC細(xì)胞中有敲低LIPC的EGFP陽性細(xì)胞及未敲低LIPC的EGFP陰性細(xì)胞)4.2取對數(shù)生長期細(xì)胞,用DID進(jìn)行膜染色標(biāo)記后,分別用0.03及0.3μM阿霉素化療10天,流式檢測HepG2-shLIPC細(xì)胞的增殖情況。5.分析與統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)均由三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得,以x±s表示。DiO-Low和DiO-High組間比較采用t檢驗(yàn)。比較不同濃度化療藥物作用下細(xì)胞的增殖采用雙因素方差分析,多組間比較采用SNK法。基因芯片數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后篩選差異表達(dá)基因,以DiO-High/DiO-Low2作為上調(diào)基因,DiO-High/DiO-Low2作為下調(diào)基因。利用DIVID工具對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能分類分析(gene ontology analysis, GO)及KEGG pathway注釋分析。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1.細(xì)胞膜熒光染料DiO/DiD對細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞膜熒光染料DiO/DiD不影響細(xì)胞增殖。MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示染料標(biāo)記細(xì)胞在第1、2、3天的增殖與未染色細(xì)胞的增殖情況無顯著差異(P0.05),說明DiO/DiD染料對細(xì)胞增殖無影響。2.細(xì)胞膜熒光染料DiO/DiD標(biāo)記細(xì)胞后在體內(nèi)外培養(yǎng)狀況。DiO陽性的HepG2細(xì)胞和DiO陰性的CT26細(xì)胞共培養(yǎng)一周后染Percp-EPCAM抗人抗體,流式檢測結(jié)果顯示,在EPCAM陰性細(xì)胞中DiO陽性細(xì)胞所占比例很低(8%±0.096%),即在體外細(xì)胞培養(yǎng)中,DiO標(biāo)記能保持較好穩(wěn)定性,在細(xì)胞間較少發(fā)生轉(zhuǎn)移。DiD陽性的HepG2細(xì)胞注射至小鼠肝被膜下生長8天后取原位瘤并制得單細(xì)胞懸液,染EPCAM抗人抗體后流式檢測,結(jié)果提示,在EPCAM陰性細(xì)胞中DiD陽性細(xì)胞所占比例很低(4.5%±0.08%),即在體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)中,細(xì)胞膜熒光染料DiD亦能保持良好穩(wěn)定性。3.建立DiO定量檢測體內(nèi)外細(xì)胞增殖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.1不同血清濃度培養(yǎng)下細(xì)胞的分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線。對細(xì)胞分裂次數(shù)及平均DiO熒光強(qiáng)度值進(jìn)行對數(shù)曲線擬合和建立擬合公式,結(jié)果分別是：Lovo:S=-1.79308log2M +16.41884, R2=0.7871; SW480:S=-2.6156 log2M末+16.37847,R2=0.9033；HCT116:S=-2.77449log2M末+29.27126, R2=0.8867; HepG2:S=-1.4299log2M末 +18.82296, R2=0.9044; SW620:S=-1.71533log2M末+1 3.34059,R2=0.9853。3.2不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞的增殖分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線。在時(shí)間窗內(nèi),分別建立CT26細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別得到：CT26:S=-1.28089log2M未+14.00148,R2=0.9941; HepG2:S=-1.0812 Iog2M末+11.56886,R2=0.9963。結(jié)果顯示,在一定時(shí)間內(nèi),DiO熒光強(qiáng)度的衰減并不影響定量檢測細(xì)胞分裂次數(shù)。4.DiO標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞在化療后的作用。DiO標(biāo)記的HepG2細(xì)胞在阿霉素化療后,明顯地分為兩個(gè)細(xì)胞亞群,我們根據(jù)DiO熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱分為DiO-Low和DiO-High亞群,染CD133抗體后發(fā)現(xiàn),DiO-High細(xì)胞亞群中CD133的表達(dá)較DiO-Low亞群顯著增高(P0.05)對化療更耐藥。5.DiO標(biāo)記在腫瘤細(xì)胞比較早期凋亡和活細(xì)胞的影響。DiO標(biāo)記的HepG2細(xì)胞在0.3μM阿霉素作用下培養(yǎng)1周,建立細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線為：S=-1.59485 log2M+17.407, R2=0.9202。用20gM阿霉素誘導(dǎo)HepG2凋亡并用試劑盒檢測細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示早期凋亡細(xì)胞的平均DiO熒光強(qiáng)度比活細(xì)胞的平均DiO熒光強(qiáng)度低,根據(jù)HepG2細(xì)胞在0.3gM阿霉素作用下的分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線S=-1.59485 log2M+17.407, R2=0.9202,計(jì)算出早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的平均分裂次數(shù)分別為3.13和2.96(P=0.035),說明分裂快的細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡,即對化療藥物更加敏感。6. DiO-High/low標(biāo)記的細(xì)胞分選及定量分析。將化療后明顯分群的兩個(gè)細(xì)胞亞群分別標(biāo)記為DiO-Low組和DiO-High組,用流式細(xì)胞分選儀對這兩群細(xì)胞進(jìn)行分選,并分別檢測分選后兩組細(xì)胞的DiO平均熒光強(qiáng)度。根據(jù)HepG2細(xì)胞在0.3μM阿霉素作用下的分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線S=-1.59485 log2M+17.407, R2=0.9202計(jì)算出兩組細(xì)胞的分裂次數(shù)為：DiO-Low組細(xì)胞平均分裂次數(shù)為9.6次,而DiO-High組細(xì)胞平均分裂次數(shù)為2.9次,兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。7. DiO-High/low標(biāo)記的cDNA表達(dá)組芯片分析。cDNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,在DiO-Low和DiO-High兩個(gè)細(xì)胞亞群中,共發(fā)現(xiàn)6521個(gè)差異表達(dá)基因(篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)≥2倍),其中2768個(gè)基因發(fā)生上調(diào),3753個(gè)基因發(fā)生下調(diào)。對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能分類分析(gene ontology analysis, GO)分析,結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對刺激的反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),其富集的生物信號(hào)學(xué)通路包括：代謝途徑、MAPK信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、腫瘤信號(hào)通路等。此外,DiO-Low和DiO-High兩個(gè)細(xì)胞亞群在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和多能性干細(xì)胞信號(hào)通路上的基因表達(dá)有顯著差異(P0.001),我們發(fā)現(xiàn)在DiO-High組中,一些重要的促凋亡基因,如BIM, BID, BAD, FAS, PRKACB, CASP7, CASP8, CASP10, CASP12表達(dá)下調(diào),而一些重要的抗凋亡基因,如DFFA, RELA, NTRK1, CFLAR則表達(dá)上調(diào),說明分裂慢的細(xì)胞對化療更耐藥,分裂快的細(xì)胞對化療更敏感。同時(shí),與促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)的基因,包括PCNA、CDK4、cyclin D2、cyclin E1、cyclin A1、 cyclin B3在DiO-Low組(即分裂較快的細(xì)胞)中表達(dá)上調(diào)。在多能性干細(xì)胞信號(hào)通路中,一些干細(xì)胞相關(guān)基因,如ABCC8、NANOS1、TCF7、FZD10等在DiO-High亞群中表達(dá)明顯上調(diào),進(jìn)一步證明了細(xì)胞膜染料DiO標(biāo)記法可用于定量檢測腫瘤細(xì)胞增殖、分離細(xì)胞亞群及后續(xù)的分子生物學(xué)研究。8.DiO標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長及定量分析。8.1 CT26細(xì)胞在BALB/c裸鼠皮下成瘤,根據(jù)CT26細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線S=-1.28089log2M末+14.00148,計(jì)算得出在第3、9、14天的分裂次數(shù)分別為1.2±0.072,2.59±0.078,5.80±0.17。8.2在BALB/c裸鼠皮下、脾被膜下種植CT26細(xì)胞,3天后分離原位瘤和轉(zhuǎn)移瘤并檢測DiO熒光強(qiáng)度,根據(jù)CT26細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線S=-1.28089log2M±14.00148,計(jì)算得出皮下原位瘤、脾臟原位瘤、肝臟轉(zhuǎn)移瘤的分裂次數(shù)分別為1.2±0.072,5.88±0.20,7.784±0.30,在脾臟中,CT26細(xì)胞的分裂速度約是皮下的5倍,說明CT26細(xì)胞在不同組織中的分裂速度不同。轉(zhuǎn)移瘤的DiO熒光強(qiáng)度顯著低于脾臟,我們推斷轉(zhuǎn)移瘤中細(xì)胞分裂速度更快。8.3在BALB/c裸鼠肝被膜下種植CT26細(xì)胞,在第3、4、5、9、10天分裂肝臟原位瘤以及其他肝葉的轉(zhuǎn)移瘤,根據(jù)根據(jù)CT26細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線S=-1.28089log2M末+14.00148,計(jì)算得出細(xì)胞分裂次數(shù)：第3天的分裂次數(shù)分別為2.14±0.30、3.61±0.73,第4天為2.67±0.44、3.99±0.22,第5天為5.69±0.44、7.86±0.33,第9天為6.92±0.26、7.63±0.07,第10天為6.86±0.96、9.15±O.40。結(jié)果提示在同一器官中,轉(zhuǎn)移腫瘤的平均熒光強(qiáng)度顯著低于原位腫瘤的熒光強(qiáng)度,進(jìn)一步證實(shí)無論是在同一個(gè)器官中還是在不同器官中,轉(zhuǎn)移瘤中細(xì)胞增殖更快。9.DiD標(biāo)記用于探究肝脂肪酶在HepG2中瘤細(xì)胞耐藥中的作用。DiD標(biāo)記的未經(jīng)陽性篩選的轉(zhuǎn)染了LV-LIPC-shRNA-EGFP的HepG2細(xì)胞,用不同濃度阿霉素化療10天后,發(fā)現(xiàn)EGFP+細(xì)胞增殖明顯減慢,而EGFP-細(xì)胞明顯分為兩群,根據(jù)DiD熒光強(qiáng)度不同分為增殖快的細(xì)胞和增殖慢的細(xì)胞,說明下調(diào)LIPC后,HepG2細(xì)胞增殖減慢,對化療產(chǎn)生抵抗。結(jié)合本課題組前期發(fā)現(xiàn),下調(diào)LIPC后HepG2細(xì)胞增殖顯著減慢,克隆形成顯著減少,且CD133陽性細(xì)胞百分比亦顯著下降,對阿霉素、5-fu化療產(chǎn)生抵抗。結(jié)論1.細(xì)胞膜熒光染料DiO/DiD標(biāo)記腫瘤細(xì)胞后不影響細(xì)胞增殖,且在體內(nèi)外培養(yǎng)中極少發(fā)生細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。2.通過建立DiO平均熒光強(qiáng)度和細(xì)胞分裂次數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線,可定量檢測腫瘤細(xì)胞的分裂增殖,且在時(shí)間窗內(nèi),熒光強(qiáng)度的衰減不影響其定量分析。3.通過定量分析裸鼠種植瘤中腫瘤細(xì)胞的分裂次數(shù),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤中細(xì)胞分裂速度更快。4.腫瘤細(xì)胞化療后根據(jù)DiO熒光強(qiáng)度強(qiáng)弱明顯分為兩個(gè)細(xì)胞亞群,且DiO-How細(xì)胞亞群的CD133表達(dá)增高,對化療更耐藥。5.凋亡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證DiO熒光強(qiáng)度低的細(xì)胞(即分裂快的細(xì)胞)更容易發(fā)生凋亡,對化療更敏感。6.基因芯片結(jié)果證實(shí),在DiO熒光強(qiáng)度高的細(xì)胞(即分裂慢的細(xì)胞)中,促進(jìn)凋亡和增殖的相關(guān)基因表達(dá)下調(diào),抗凋亡基因和干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。7.下調(diào)LIPC表達(dá)后,抑制HepG2細(xì)胞增殖和克隆形成,CD133表達(dá)下降,對阿霉素、5-FU化療耐藥。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.43

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本文編號(hào)：1581778