本文選題：腎癌　切入點：雄激素受體　出處：《華中科技大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分AR促進RCC細胞增殖和侵襲遷移的功能研究目的檢測雄激素受體(AR)在腎癌(RCC)中的表達,構(gòu)建干擾和過表達AR的RCC細胞系,通過檢測干擾或過表達AR的RCC細胞系增殖和遷移侵襲能力的差異,探討AR對RCC細胞增殖和遷移侵襲的功能影響。方法Western blot檢測OSRC-2、HK、ACHN和SW-839細胞中AR的表達情況。并以AR陽性前列腺癌(PCa)細胞系C4-2和AR陰性PCa細胞系PC-3作為AR對照,GAPDH作為內(nèi)參。構(gòu)建穩(wěn)定低表達AR (sh-AR)的SW-839的細胞系及穩(wěn)定高表達AR(OE AR)的OSRC-2、ACHN細胞系。Western blot檢測sh-AR SW-839細胞中AR的表達情況以及OEAR的OSRC-2、ACHN細胞系中AR的表達情況,以驗證所構(gòu)建細胞系是否成功。采用Transwell Assay檢測sh-AR的SW-839細胞和OE AR的OSRC、ACHN細胞遷移和侵襲的能力。并兩兩比較組問RCC細胞侵襲能力差異：①sh-AR的SW-839細胞組對比scr對照組；②OE AR的OSRC-2、ACHN細胞組對比空載質(zhì)粒對照組(Vec),并做統(tǒng)計學分析組間差異。利用3D spheroid侵襲試驗進一步證實Transwell侵襲實驗的結(jié)果：①sh-AR的SW-839細胞組對比scr對照組;② OEAR的OSRC-2細胞組對比Vec對照組,并做統(tǒng)計學分析組問差異。最后采用MTT增殖實驗在細胞增殖能力差異的角度論證調(diào)控AR表達對RCC進展的影響：① sh-AR的SW-839細胞組對比scr對照組；② OE AR的OSRC-2、ACHN細胞組對比Vec對照組,并做統(tǒng)計學分析組間差異。結(jié)果我們首先檢測了AR在各種RCC細胞系中的表達情況,發(fā)現(xiàn)AR在SW-839細胞系中高表達,而在OSRC-2、ACHN細胞系中低表達。然后我們通過調(diào)節(jié)AR的表達水平研究AR在RCC進展中所扮演的角色。采用Transwell Assay檢測細胞遷移和侵襲的能力,我們發(fā)現(xiàn)與各自相應的對照組相比,干擾SW-839細胞AR的表達可以抑制細胞侵襲。而過表達AR的OSRC-2、ACHN細胞獲得更強的侵襲能力。通過3D spheroid侵襲實驗我們得到了與Transwell Assay類似的結(jié)果,與各自相應的對照組相比,干擾SW-839細胞AR的表達可以抑制細胞侵襲。而過表達AR的OSRC-2、ACHN細胞獲得了更強的侵襲能力。我們還用MTT法檢測AR表達程度對各個細胞系增殖能力的影響,與各自相應的對照組相比,干擾AR的表達使得SW-839增殖能力明顯下降,而過表達AR的OSRC-2、ACHN細胞增殖能明顯上升。經(jīng)統(tǒng)計學分析,所有組問差異P0.05。結(jié)論首先,sh-AR SW-839的細胞系及OE AR的OSRC-2、ACHN細胞系構(gòu)建成功。AR在普通OSRC-2、ACHN細胞中低表達,在普通SW-839細胞中高表達。AR可以促進RCC細胞的增殖和遷移侵襲。以上結(jié)論為下一步探討AR促進RCC增殖和侵襲遷移能力的機制奠定了基礎。第二部分MiR-145受AR負性調(diào)節(jié)抑制腎癌細胞的增殖和侵襲遷移的功能研究目的研究miR-145在RCC中的表達水平以及與AR表達的相關性。研究miR-145對RCC增殖和侵襲遷移的影響。方法采用Real-time PCR來檢測AR對下游一系列miRNA差異性表達的影響。PCR檢測分析驗證AR對miR-145的影響。應用Real-time PCR對RCC臨床標本的癌組織及癌旁組織中AR和miR-145的表達情況進行檢測并做相關性分析。通過Transwell assay和MTT assay檢測同時調(diào)控AR和miR-145的表達對RCC細胞增殖和遷移侵襲的影響。結(jié)果我們采用Real-time PCR發(fā)現(xiàn)人為調(diào)控AR的表達水平后,在一系列的miRNA差異變化中miR-145差異性表達最顯著。同時采用PCR分別在SW-839和OSRC-2、ACHN細胞中驗證了干擾AR后miR-145差異性高表達(P0.01);過表達AR后miR-145差異性低表達(P0.01)。最后我們檢測20例RCC患者,癌組織與癌旁組織中AR及miR-145的表達情況,發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中AR高表達而在癌旁組織中miR-145高表達,相關性分析提示AR和miR-145表達呈負相關(r=-0.453,p=0.045,n=20)。通過Transwell assay和MTT assay我們發(fā)現(xiàn)過表達miR-145或過表達AR可以分別抑制或促進RCC細胞的侵襲和增殖。反之,抑制miR-145或抑制AR后可以分別促進或抑制RCC細胞的侵襲和增殖。結(jié)論我們通過實驗,多角度論證了在RCC細胞中AR可以抑制miR-145的表達。AR的表達與miR-145的表達成呈負相關。miR-145受AR的負性調(diào)節(jié)抑制RCC的增殖和侵襲遷移。第三部分AR-miR-145-HIF2a軸在腎癌中分子機制研究目的研究AR抑制miR-145的作用機制以及AR抑制的miR-145通路影響RCC進展的作用機制。方法通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測AR是否結(jié)合到miR-145的啟動子區(qū)域。采用western blot檢測AR是否通過p53抑制miR-145的表達。建立穩(wěn)定低表達AR(sh-AR)和穩(wěn)定高表達AR (OE-AR)的RCC細胞系,通過western blot檢測低表達AR及高表達AR時,HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1的表達變化來研究AR與HIF2a、VEGF、MMP9和CCND1的影響關系。通過western blot檢測轉(zhuǎn)染了miR-145 mimic后,HIF2a、VEGF、MMP9和CCND1的表達變化,來了解它們之間的影響關系。通過western blot檢測sh-AR的SW-839細胞及OEAR的OSRC-2細胞中分別轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor及miR-145 mimic前后HIF2α、 VEGF、MMP9和CCND1表達變化來了解在VHL突變型RCC細胞系中AR抑制miR-145發(fā)揮促癌作用的機制。在VHL野生型ACHN細胞中的類似研究,探討AR-VHL通路與AR-miR-145通路的關系。結(jié)果AR反應元件(ARE)位于miR-145轉(zhuǎn)錄起始區(qū)上游575個堿基處。通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)AR通過與miR-145啟動子區(qū)域的ARE結(jié)合從而抑制miR-145的表達。提示AR能在轉(zhuǎn)錄層面調(diào)控miR-145的表達。通過western blot實驗我們觀察到sh-AR所誘導miR-145的表達增加程度可以被抑制p53表達(p53-shRNA)減弱,說明p53在AR的上游調(diào)控miR-145的表達。AR可以通過與miR-145啟動子區(qū)域的ARE直接結(jié)合來抑制p53對miR-145轉(zhuǎn)錄的激活。通過western blot發(fā)現(xiàn)AR可以增加HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1的表達;而miR-145能降低HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1的表達,另外通過轉(zhuǎn)染miR-145 mimic或miR-145 inhibitor可以一定程度上逆轉(zhuǎn)AR對HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1表達的影響,說明在VHL突變型SW-839及OSRC-2細胞中AR抑制miR-145發(fā)揮促癌作用是通過激活HIF2a/VEGF/MMP9/CCND 1信號通路來的實現(xiàn)的。在VHL野生型ACHN細胞中,miR-145抑制VHL表達；轉(zhuǎn)染miR-145 mimic可以逆轉(zhuǎn)AR對VHL表達的促進作用及AR對VHL下游通路的激活作用。無論是在VHL突變型還是VHL野生型RCC細胞中,AR抑制miR-145通路在RCC進展中都扮演重要角色,其作用是通過激活HIF2a/VEGF/MMP9/CCND 1信號通路來實現(xiàn)的。結(jié)論AR通過調(diào)控p53來抑制miR-145啟動子活性。AR通過miR-145調(diào)節(jié)HIF2a的表達。無論是在VHL野生型還是VHL突變型RCC細胞中,AR-miR-145-HIF2a軸對于RCC的進展都起著至關重要的作用。第四部分AR通過抑制miR-145促進腎癌生長和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)實驗研究目的通過體內(nèi)實驗證實了AR通過抑制miR-145促進RCC進展,這種作用是通過誘導HIF2a表達上調(diào)來實現(xiàn)的。方法首先構(gòu)建了高表達AR(OEAR)及高表達miR-145(OE miR-145)的OSRC-2細胞細胞系。通過PCR檢測構(gòu)建好的細胞系中miR-145的表達情況。將分組好的OSRC-2細胞原位異種移植到裸鼠腎包膜下,使用IVIS成像系統(tǒng)(體外成像)監(jiān)測腫瘤進展對比腫瘤的大小。處死小鼠,取出腎臟及腫瘤。按照分組對比腫瘤的質(zhì)量,統(tǒng)計學方法檢驗有無差異。觀察RCC在膈肌及肝門的轉(zhuǎn)移情況,比較各組間RCC轉(zhuǎn)移發(fā)生的情況及轉(zhuǎn)移灶的多寡。HE染色確認轉(zhuǎn)移灶是否為RCC細胞。免疫組化確認AR/HIF2a/VEGF/MMP9/CCND1在不同組別的表達情況是否與第三部分采用western blot檢測所得結(jié)果相同。結(jié)果構(gòu)建并驗證穩(wěn)定高表達miR-145的OSRC-2細胞系。PCR驗證效果,兩組之間比較miR-145的表達水平有顯著差異(P0.01),說明細胞系構(gòu)建成功。5周以后觀察結(jié)果。與對照組Vec-AR相比,過表達AR的OSRC-2細胞導致裸鼠體內(nèi)腫瘤生長速度和腫瘤質(zhì)量明顯增加；而穩(wěn)定表達miR-145的OE-AR OSRC-2細胞可以部分逆轉(zhuǎn)AR促癌作用,并減少RCC腫瘤生長速度和腫瘤重量。通過IVIS圖像系統(tǒng)發(fā)現(xiàn),OE-AR組的6只裸鼠中5只發(fā)生轉(zhuǎn)移；對照組有2只發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。而在OE-AR+OE-miR-145組只有1只老鼠發(fā)生轉(zhuǎn)移;OE-miR-145組沒有老鼠發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。HE染色證實了裸鼠腎臟以及轉(zhuǎn)移灶的腫瘤都是RCC細胞。免疫組化確認AR/HIF2α/VEGF/MMP9/CCND1在不同組別的表達情況與第三部分采用western blot檢測所得結(jié)果相同。結(jié)論通過體內(nèi)實驗證實了AR通過抑制miR-145激活下游HIF2α/VEGF/ MMP9/CCND1等因子而促進RCC生長和轉(zhuǎn)移的機制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11

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