發(fā)布時(shí)間：2018-03-06 18:40

  本文選題：乙型肝炎病毒　切入點(diǎn)：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)突變與肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的相關(guān)性一直是乙肝病毒致癌作用研究的熱點(diǎn)。然而,從感染HBV到HCC,往往經(jīng)歷“慢乙肝-肝硬化-HCC”這一漫長過程,加之HBV基因組易于變異和宿主的免疫選擇壓力,感染者體內(nèi)的HBV往往存在與“野生序列”高度相關(guān)但不完全相同的變異株的動(dòng)態(tài)種群,即準(zhǔn)種。這一現(xiàn)象提示我們,每一個(gè)體內(nèi)HBV的突變往往隨著感染時(shí)間和疾病進(jìn)程而逐漸增加。在既往研究中,通過比較HBV感染不同時(shí)期的患者外周血中病毒的突變情況,發(fā)現(xiàn)了與HCC相關(guān)的HBV突變。但由于肝癌患者血清中的HBV突變來自于肝癌組織和非癌肝組織中的cccDNA突變,并且癌組織中病毒復(fù)制能力相對(duì)較弱。因此,血清中病毒DNA的突變不能有效地反映肝癌組織中HBV cccDNA的突變情況。HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)只存在于感染的肝細(xì)胞核中,是HBV復(fù)制的模板,具有一定的組織特異性。同時(shí),為消除不同感染階段這一時(shí)間因素對(duì)HBV變異程度的影響,本實(shí)驗(yàn)通過比較HCC患者配對(duì)的肝癌與癌旁組織中HBV cccDNA突變位點(diǎn)的差異,分析這些病毒突變的臨床相關(guān)性,尋找與HCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的病毒突變位點(diǎn),開展與HCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的病毒突變位點(diǎn)相應(yīng)的功能研究,探索HBV基因組突變的可能致癌機(jī)制。本研究采用29例HCC患者術(shù)后的癌與癌旁組織,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)組織中HBV cccDNA和HBV total DNA水平,滾環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物直接測(cè)序HBV cccDNA全基因組,與野生序列比對(duì)尋找HBV cccDNA的突變位點(diǎn),并分析HBV cccDNA突變位點(diǎn)的臨床相關(guān)性。以HBV 1.2×質(zhì)粒為基礎(chǔ),通過定點(diǎn)突變技術(shù),構(gòu)建HBV 1.2×-G588C突變及HBV 1.2×-T1719G突變質(zhì)粒,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒突變位點(diǎn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)3.5kb RNA和total RNA及上清中HBV DNA水平的影響,用時(shí)間分辨熒光法檢測(cè)病毒突變位點(diǎn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBs Ag和HBeAg含量的影響。采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T1719G突變后是否對(duì)HBV Enh II的活性有影響,并進(jìn)一步通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)-PCR技術(shù)檢測(cè)T1719G突變后對(duì)HNF3β與EnhII之間結(jié)合力的影響。通過分別與野生型HBx質(zhì)粒及HBx-T1719G突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,檢測(cè)T1719G突變的HBx蛋白對(duì)HBV復(fù)制能力的影響。研究結(jié)果如下:(1)完成了25個(gè)癌組織標(biāo)本和29個(gè)癌旁組織標(biāo)本中hbvcccdna的全基因組測(cè)序,其中有19對(duì)是配對(duì)的癌組織與癌旁組織。在19對(duì)hbvcccdna序列中,18對(duì)是c基因型,1對(duì)是b基因型。25個(gè)癌組織的hbvcccdna序列中23個(gè)是hbvc基因型。將所得到的18對(duì)c基因型的cccdna序列與hbv的野生序列進(jìn)行比對(duì),獲得hbvcccdna全基因組的突變位點(diǎn)。以突變率大于10%的作為突變熱點(diǎn),共篩選出突變熱點(diǎn)233個(gè)。完成了29對(duì)癌與癌旁組織hbvcccdna和totaldna的定量檢測(cè)。(2)將23個(gè)癌組織中的各突變位點(diǎn)與患者的臨床資料(術(shù)后生存時(shí)間,bclc分級(jí)、術(shù)前afp濃度等)及hbvdna定量結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示t1719g、c1329a和t3098c突變與患者的術(shù)后生存時(shí)間相關(guān),攜帶突變型a1329或c3098的肝癌患者術(shù)后生存時(shí)間長于攜帶野生型c1329或t3098的患者,而g1719突變組肝癌患者的術(shù)后生存時(shí)間短于t1719野生型組;g1078t、c1653t、g1727a、c1913a、t1978c和c3116t突變位點(diǎn)與患者術(shù)前高濃度的afp相關(guān);t1719g和c1913a兩個(gè)突變位點(diǎn)與hbvdna定量結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中,突變型g1719組hbvcccdna和hbvtotaldna含量均低于野生型t1719組,突變型a1913組hbvcccdna的含量高于野生型c1913組;我們還發(fā)現(xiàn),突變位點(diǎn)t1719g與患者的bclc分級(jí)相關(guān),t1719野生型組傾向于較低的bclc分級(jí),g1719突變型組傾向于較高的bclc分級(jí)結(jié)果提示t1719g突變后患者的預(yù)后差;并且cox多因素分析結(jié)果顯示t1719g突變是hcc患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立的危險(xiǎn)預(yù)后預(yù)測(cè)因素,而t3098c突變是hcc患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立的保護(hù)預(yù)后因素。(3)g588c突變(可引起g145a氨基酸突變)只存在于3例癌組織(7c、569c、831c)中,提示g588c突變可能與hcc的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。g588c突變型組上清中hbsag的含量低于野生型組(p0.05),g588c突變型組細(xì)胞內(nèi)的hbsag的含量高于野生型組(p0.05),g588c突變型組hbsag的總量和hbv1.2×野生型組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),而g588c突變型組上清中hbsag與細(xì)胞內(nèi)hbsag的比值明顯低于hbv1.2×野生型組(p0.05),并且,g588c突變型組上清中hbvdna水平與hbv1.2×野生型組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)果表明g588c突變不影響hbv的復(fù)制能力,也不影響hbsag的表達(dá),而可能影響了hbsag從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外的分泌。(4)在huh7和hepg2肝癌細(xì)胞中,hbv1.2×-t1719g突變型質(zhì)粒與hbv1.2×野生型質(zhì)粒相比,可以明顯降低培養(yǎng)上清中hbsag和hbeag的含量(p0.001)、細(xì)胞內(nèi)HBV total RNA和3.5kb RNA水平(p0.001)、細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA水平(p0.001),雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在Huh7、HepG2、SK-Hep1和HEK293T四種肝癌細(xì)胞中,T1719G突變組的Enh II的活性低于野生型組(p0.001),當(dāng)野生型質(zhì)粒和T1719G突變型質(zhì)粒分別與HNF3β質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí),T1719G突變組的EnhII的活性也低于野生型組(p0.001),提示T1719G突變既降低了EnhII活性,又影響了HNF3β對(duì)Enh II的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明T1719G突變影響了HNF3β和HBV EnhII之間的結(jié)合力,突變型G1719與HNF3β之間的結(jié)合力弱于T1719與HNF3β之間的結(jié)合力。在Huh7和HepG2細(xì)胞中,當(dāng)HBV 1.2×和HBV 1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染時(shí),與未共轉(zhuǎn)染組相比上清中HBsAg和HBe Ag的水平?jīng)]有明顯變化(p0.05);但當(dāng)HBV 1.2×和HBV 1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染時(shí),與未共轉(zhuǎn)染組相比,上清中HBsAg和HBeAg的水平仍然明顯下降(p0.001);并且,HBV 1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組上清中的HBsAg和HBe Ag的水平低于HBV 1.2×質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組(p0.001);而HBV 1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組上清中的HBsAg和HBeAg的水平與HBV1.2×質(zhì)粒與HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);當(dāng)HBV 1.2×和HBV 1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx質(zhì)�；騂Bx-mut突變質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染時(shí),與未共轉(zhuǎn)染組相比上清中HBV DNA的水平都升高(p0.001);但HBV 1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組上清中HBV DNA的水平低于HBV 1.2×質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001);而HBV 1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組上清中HBV DNA的水平與HBV 1.2×質(zhì)粒與HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組相比,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。這些結(jié)果表明T1719G突變可以降低HBV的復(fù)制能力,其中突變的HBV EnhII和突變的HBx蛋白都起到了重要的作用。結(jié)果表明癌與癌旁組織中存在差異趨勢(shì)的突變位點(diǎn)有可能是HCC發(fā)生的重要病毒學(xué)因素,通過與臨床信息分析找到了一些具有臨床相關(guān)性的突變位點(diǎn),G588C突變可能影響HBsAg的分泌,T1719G突變與患者的BCLC分級(jí)、患者的術(shù)后生存時(shí)間有關(guān),是HCC患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)預(yù)測(cè)因素,并且T1719G與HBV的復(fù)制能力有關(guān),通過細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)證實(shí)了T1719G突變可以降低HBV的復(fù)制能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R512.62;R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 Xiu-ting He;Hong-qin Xu;Xiao-Mei Wang;Xiu-shu He;Jun-qi Niu;Pu-Jun Gao;;Association between polymorphisms of the APOBEC3G gene and chronic hepatitis B viral infection and hepatitis B virusrelated hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2017年02期

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3 Hye Won Lee;Sang Hoon Ahn;;Prediction models of hepatocellular carcinoma development in chronic hepatitis B patients[J];World Journal of Gastroenterology;2016年37期

4 Chuck C K Chao;;Inhibition of apoptosis by oncogenic hepatitis B virus X protein: Implications for the treatment of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Hepatology;2016年25期

5 Doo Hyun Kim;Hong Seok Kang;Kyun-Hwan Kim;;Roles of hepatocyte nuclear factors in hepatitis B virus infection[J];World Journal of Gastroenterology;2016年31期

6 Danbi Lee;Heather Lyu;Young-Hwa Chung;Jeong A Kim;Priya Mathews;Elizabeth Jaffee;Lei Zheng;Eunsil Yu;Young Joo Lee;Soo Hyung Ryu;;Genomic change in hepatitis B virus associated with development of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2016年23期

7 胡威;魏肖;周凱;孔凡運(yùn);寇艷波;房賢達(dá);李向陽;尤紅娟;鄭葵陽;湯仁仙;;C端截?cái)嗟腍BX突變體通過上調(diào)DR4和DR5表達(dá)促TRAIL誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡[J];免疫學(xué)雜志;2016年06期

8 陳珊珊;陳浩;高珊珊;周虎;邱石黎;喻明霞;涂建成;;血漿miR-205在乙肝病毒相關(guān)肝臟疾病中的表達(dá)及其作為乙肝病毒所致肝細(xì)胞癌診斷標(biāo)志物的價(jià)值[J];武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2016年03期

9 Xiao-Ling Wang;Jian-Ping Ren;Xue-Qing Wang;Xiao-Hong Wang;Shao-Fang Yang;Yi Xiong;;Mutations in pre-core and basic core promoter regions of hepatitis B virus in chronic hepatitis B patients[J];World Journal of Gastroenterology;2016年11期

10 Yong-Wei Li;Feng-Cai Yang;Hui-Qiong Lu;Jiong-Shan Zhang;;Hepatocellular carcinoma and hepatitis B surface protein[J];World Journal of Gastroenterology;2016年06期

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本文編號(hào)：1576021