本文選題：乙型肝炎病毒　切入點：共價閉合環(huán)狀DNA　出處：《山東農業(yè)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)突變與肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的相關性一直是乙肝病毒致癌作用研究的熱點。然而,從感染HBV到HCC,往往經歷“慢乙肝-肝硬化-HCC”這一漫長過程,加之HBV基因組易于變異和宿主的免疫選擇壓力,感染者體內的HBV往往存在與“野生序列”高度相關但不完全相同的變異株的動態(tài)種群,即準種。這一現(xiàn)象提示我們,每一個體內HBV的突變往往隨著感染時間和疾病進程而逐漸增加。在既往研究中,通過比較HBV感染不同時期的患者外周血中病毒的突變情況,發(fā)現(xiàn)了與HCC相關的HBV突變。但由于肝癌患者血清中的HBV突變來自于肝癌組織和非癌肝組織中的cccDNA突變,并且癌組織中病毒復制能力相對較弱。因此,血清中病毒DNA的突變不能有效地反映肝癌組織中HBV cccDNA的突變情況。HBV共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)只存在于感染的肝細胞核中,是HBV復制的模板,具有一定的組織特異性。同時,為消除不同感染階段這一時間因素對HBV變異程度的影響,本實驗通過比較HCC患者配對的肝癌與癌旁組織中HBV cccDNA突變位點的差異,分析這些病毒突變的臨床相關性,尋找與HCC發(fā)生、發(fā)展相關的病毒突變位點,開展與HCC發(fā)生、發(fā)展相關的病毒突變位點相應的功能研究,探索HBV基因組突變的可能致癌機制。本研究采用29例HCC患者術后的癌與癌旁組織,通過實時熒光定量PCR檢測組織中HBV cccDNA和HBV total DNA水平,滾環(huán)擴增及PCR產物直接測序HBV cccDNA全基因組,與野生序列比對尋找HBV cccDNA的突變位點,并分析HBV cccDNA突變位點的臨床相關性。以HBV 1.2×質粒為基礎,通過定點突變技術,構建HBV 1.2×-G588C突變及HBV 1.2×-T1719G突變質粒,采用實時熒光定量PCR技術檢測病毒突變位點對細胞內3.5kb RNA和total RNA及上清中HBV DNA水平的影響,用時間分辨熒光法檢測病毒突變位點對細胞培養(yǎng)上清中HBs Ag和HBeAg含量的影響。采用雙熒光素酶報告實驗檢測T1719G突變后是否對HBV Enh II的活性有影響,并進一步通過染色質免疫共沉淀技術(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)-PCR技術檢測T1719G突變后對HNF3β與EnhII之間結合力的影響。通過分別與野生型HBx質粒及HBx-T1719G突變型質粒共轉染,檢測T1719G突變的HBx蛋白對HBV復制能力的影響。研究結果如下:(1)完成了25個癌組織標本和29個癌旁組織標本中hbvcccdna的全基因組測序,其中有19對是配對的癌組織與癌旁組織。在19對hbvcccdna序列中,18對是c基因型,1對是b基因型。25個癌組織的hbvcccdna序列中23個是hbvc基因型。將所得到的18對c基因型的cccdna序列與hbv的野生序列進行比對,獲得hbvcccdna全基因組的突變位點。以突變率大于10%的作為突變熱點,共篩選出突變熱點233個。完成了29對癌與癌旁組織hbvcccdna和totaldna的定量檢測。(2)將23個癌組織中的各突變位點與患者的臨床資料(術后生存時間,bclc分級、術前afp濃度等)及hbvdna定量結果進行了統(tǒng)計分析,結果顯示t1719g、c1329a和t3098c突變與患者的術后生存時間相關,攜帶突變型a1329或c3098的肝癌患者術后生存時間長于攜帶野生型c1329或t3098的患者,而g1719突變組肝癌患者的術后生存時間短于t1719野生型組;g1078t、c1653t、g1727a、c1913a、t1978c和c3116t突變位點與患者術前高濃度的afp相關;t1719g和c1913a兩個突變位點與hbvdna定量結果有統(tǒng)計學意義,其中,突變型g1719組hbvcccdna和hbvtotaldna含量均低于野生型t1719組,突變型a1913組hbvcccdna的含量高于野生型c1913組;我們還發(fā)現(xiàn),突變位點t1719g與患者的bclc分級相關,t1719野生型組傾向于較低的bclc分級,g1719突變型組傾向于較高的bclc分級結果提示t1719g突變后患者的預后差;并且cox多因素分析結果顯示t1719g突變是hcc患者術后生存時間的獨立的危險預后預測因素,而t3098c突變是hcc患者術后生存時間的獨立的保護預后因素。(3)g588c突變(可引起g145a氨基酸突變)只存在于3例癌組織(7c、569c、831c)中,提示g588c突變可能與hcc的發(fā)生發(fā)展有關。g588c突變型組上清中hbsag的含量低于野生型組(p0.05),g588c突變型組細胞內的hbsag的含量高于野生型組(p0.05),g588c突變型組hbsag的總量和hbv1.2×野生型組之間的差異無統(tǒng)計學意義(p0.05),而g588c突變型組上清中hbsag與細胞內hbsag的比值明顯低于hbv1.2×野生型組(p0.05),并且,g588c突變型組上清中hbvdna水平與hbv1.2×野生型組之間的差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。結果表明g588c突變不影響hbv的復制能力,也不影響hbsag的表達,而可能影響了hbsag從細胞內向細胞外的分泌。(4)在huh7和hepg2肝癌細胞中,hbv1.2×-t1719g突變型質粒與hbv1.2×野生型質粒相比,可以明顯降低培養(yǎng)上清中hbsag和hbeag的含量(p0.001)、細胞內HBV total RNA和3.5kb RNA水平(p0.001)、細胞培養(yǎng)上清中HBV DNA水平(p0.001),雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn),在Huh7、HepG2、SK-Hep1和HEK293T四種肝癌細胞中,T1719G突變組的Enh II的活性低于野生型組(p0.001),當野生型質粒和T1719G突變型質粒分別與HNF3β質粒共轉染時,T1719G突變組的EnhII的活性也低于野生型組(p0.001),提示T1719G突變既降低了EnhII活性,又影響了HNF3β對Enh II的轉錄調控活性。ChIP-PCR實驗結果表明T1719G突變影響了HNF3β和HBV EnhII之間的結合力,突變型G1719與HNF3β之間的結合力弱于T1719與HNF3β之間的結合力。在Huh7和HepG2細胞中,當HBV 1.2×和HBV 1.2×-T1719G質粒與HBx質粒共同轉染時,與未共轉染組相比上清中HBsAg和HBe Ag的水平沒有明顯變化(p0.05);但當HBV 1.2×和HBV 1.2×-T1719G質粒與HBx-mut質粒共同轉染時,與未共轉染組相比,上清中HBsAg和HBeAg的水平仍然明顯下降(p0.001);并且,HBV 1.2×-T1719G質粒與HBx-mut質粒共轉染組上清中的HBsAg和HBe Ag的水平低于HBV 1.2×質粒與HBx-mut質粒共轉染組(p0.001);而HBV 1.2×-T1719G質粒與HBx質粒共轉染組上清中的HBsAg和HBeAg的水平與HBV1.2×質粒與HBx質粒共轉染組相比差異沒有統(tǒng)計學意義(p0.05);當HBV 1.2×和HBV 1.2×-T1719G質粒與HBx質�；騂Bx-mut突變質粒共同轉染時,與未共轉染組相比上清中HBV DNA的水平都升高(p0.001);但HBV 1.2×-T1719G質粒與HBx-mut質粒共轉染組上清中HBV DNA的水平低于HBV 1.2×質粒與HBx-mut質粒共轉染組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.001);而HBV 1.2×-T1719G質粒與HBx質粒共轉染組上清中HBV DNA的水平與HBV 1.2×質粒與HBx質粒共轉染組相比,差異沒有統(tǒng)計學意義(p0.05)。這些結果表明T1719G突變可以降低HBV的復制能力,其中突變的HBV EnhII和突變的HBx蛋白都起到了重要的作用。結果表明癌與癌旁組織中存在差異趨勢的突變位點有可能是HCC發(fā)生的重要病毒學因素,通過與臨床信息分析找到了一些具有臨床相關性的突變位點,G588C突變可能影響HBsAg的分泌,T1719G突變與患者的BCLC分級、患者的術后生存時間有關,是HCC患者術后生存時間的獨立危險預測因素,并且T1719G與HBV的復制能力有關,通過細胞水平實驗證實了T1719G突變可以降低HBV的復制能力。
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【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R512.62;R735.7

【參考文獻】

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本文編號：1576021