本文選題：AIMP2-DX2　切入點：鼻咽癌　出處：《暨南大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是來源于鼻咽上皮組織的一種頭頸部惡性腫瘤,大多數(shù)為非角化未分化癌,其惡性化程度高,極易轉(zhuǎn)移,早期診斷困難。我國是鼻咽癌高發(fā)病率國家,在我國南方特別是廣東省發(fā)病率高。鼻咽癌患者的治療以放療和化療為主,而早期診斷、早期治療則是挽救患者生命和提高生活質(zhì)量的有效手段。但鼻咽癌起病隱匿,有較強的轉(zhuǎn)移傾向,轉(zhuǎn)移早,易復發(fā),大約75%左右患者首診既被確診為中晚期。鼻咽癌患者的五年生存率維持在70%左右,仍有30%多的患者由于轉(zhuǎn)移和復發(fā)不能長期生存。因此,闡明鼻咽癌發(fā)生,復發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機制,篩選鼻咽癌的腫瘤標志物,尋找治療新靶點對鼻咽癌診療具有重要的臨床意義。多能氨�；�-t RNA合成酶作用蛋白(Aminoacyl-t RNA synthetase interacting multifunctional proteins,AIMPs)是人類t RNA合成酶復合物的支架蛋白,也是�；�-t RNA連接酶復合物的核心蛋白。AIMPs家族有三個亞型蛋白:AIMP1,AIMP2,AIMP3。AIMP2(也被稱為p38/JTV-1蛋白),是AIMPs家族三個亞型之一,參與多種生物學功能,如細胞分化,細胞凋亡等。最近的研究表明,AIMP2的一個缺少外顯子Exon2的轉(zhuǎn)錄本AIMP2-DX2也與腫瘤相關,但功能與AIMP2不同。AIMP2-DX2在多種腫瘤細胞系及腫瘤組織中被檢測到。與AIMP2類似,AIMP2-DX2也能夠結(jié)合FBP、TRAF2及p53,故AIMP2-DX2與AIMP2競爭性結(jié)合目標蛋白,從而抑制AIMP2的功能,表現(xiàn)為促癌因子。AIMP2-DX2與AIMP2的比例與肺癌病人的惡性程度正相關,與卵巢癌的抗藥性正相關。抑制AIMP2-DX2水平可顯著抑制肺癌細胞分化及其在裸鼠體內(nèi)的成瘤。這些研究表明,AIMP2-DX2可能是有潛力的癌癥新靶點。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組鋅依賴型的蛋白水解酶,它主要是負責細胞外基質(zhì)蛋白的降解和重塑。MMPs在成體組織中的表達和活性相對較低,但在出現(xiàn)病理狀況異常的組織中顯著增加,例如炎性疾病,腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。近年來,MMPs是抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制研究的熱點。在各種MMPs成員中,MMP-2和MMP-9與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移表型關系最為密切,其主要作用底物是IV型膠原、明膠、彈力蛋白等,它們是基底膜及ECM的主要成分�；啄さ慕到庖馕吨[瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。鼻咽癌組織中MMP-2和MMP-9的活性水平均顯著高于正常鼻咽組織,并且與鼻咽癌的臨床分期密切相關。文獻表明,抑制MMP-2及MMP-9可以抑制鼻咽癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。所以,MMP-2及MMP-9對鼻咽癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移至關重要,是抑制其侵襲及轉(zhuǎn)移的關鍵靶點。目前AIMP2-DX2在鼻咽癌中的作用未見報道,而AIMP2-DX2調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機制也亟待闡明,本研究以人高分化鼻咽癌細胞株(CNE-1)為研究對象,擬通過分子克隆、轉(zhuǎn)染、q PCR和T-PCR、western blot等分子生物學手段,流式細胞術、MTT、transwell侵襲及遷移等實驗方法,進一步建立CNE-1鼻咽癌細胞的裸鼠成瘤模型,觀察AIMP2-DX2對鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響,檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)中關鍵分子MMP-2及MMP-9核酸水平和蛋白水平的變化,闡明MMP-2及MMP-9水平變化與AIMP2-DX2的關系,探討AIMP2-DX2調(diào)控鼻咽癌細胞遷移與侵襲的相關機制。目的(1)明確AIMP2-DX2與鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的關系。(2)研究MMP-2及MMP-9水平變化與AIMP2-DX2的關系,探討AIMP2-DX2調(diào)控鼻咽癌細胞遷移與侵襲的相關機制。材料和方法(1)應用免疫組化、Western blot及q RT-PCR技術檢測正常鼻咽組織與臨床病人鼻咽癌樣本中AIMP2-DX2和AIMP2-F(全長)的表達差異。(2)通過Western blot、RT-PCR及侵襲遷移實驗比較正常鼻咽細胞與鼻咽癌細胞相關促癌基因的表達情況以及侵襲遷移的情況;構建AIMP2-DX2真核過表達質(zhì)粒,應用細胞增殖實驗、細胞體外侵襲實驗,流式細胞術等實驗手段觀察AIMP2-DX2對腫瘤細胞生長、遷移和侵襲、凋亡的影響。(3)構建沉默sh AIMP2-DX2的CNE-1穩(wěn)定細胞株,AIMP2-DX2基因沉默對鼻咽癌細胞遷移和侵襲的影響。(4)構建鼻咽癌裸鼠成瘤動物模型,檢測沉默AIMP2-DX2對裸鼠鼻咽癌模型皮下成瘤性影響。(5)所有統(tǒng)計處理均用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±standard deviation,SD)表示,采用方差分析進行差異顯著性分析(ANOVA),P0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果(1)與正常鼻咽樣本相比,臨床病人鼻咽癌樣本中AIMP2-DX2的表達明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);AIMP2-F無顯著變化;q RT-PCR結(jié)果提示鼻咽癌組織與正常鼻咽組織相比AIMP2-DX2的表達明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);而二者AIMP2-F表達無明顯差異。AIMP2-DX2低表達組的5年生存率明顯高于AIMP2-DX2高表達組,兩者之間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.018),提示AIMP2-DX2的表達量與鼻咽癌患者的預后相關。(2)Transwell小室遷移和Matrigel侵襲實驗結(jié)果提示CNE-1細胞株中AIMP2-DX2過表達和干擾的結(jié)果表明,細胞的遷移和侵襲與AIMP2-DX2的表達成正相關。(3)與人永生化鼻咽上皮細胞系比較,鼻咽癌細胞系中AIMP2-DX2的m RNA水平及蛋白水平升高,基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2及MMP-9的水平升高,細胞的遷移和侵襲能力增強,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。(4)q RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示sh-AIMP2-DX2慢病毒能明顯抑制CNE-1細胞AIMP2-DX2的表達,抑制AIMP2-DX2顯著抑制鼻咽CNE-1細胞的遷移和侵襲,同時也能抑制在CNE-1細胞的侵襲和浸潤過程中起到重要作用的調(diào)節(jié)蛋白MMP-2及MMP-9的表達,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。(5)在裸鼠成瘤模型中,CNE-1細胞系的腫瘤成瘤可被sh-AIMP2-DX2抑制。結(jié)論(1)臨床病人鼻咽癌組織中AIMP2-DX2的表達明顯增高,且與病人預后相關。(2)AIMP2-DX2是調(diào)控鼻咽癌細胞增殖,遷移和侵襲能力的充分必要條件(過表達及小分子干擾)。(3)sh-AIMP2-DX2慢病毒能明顯抑制CNE-1細胞AIMP2-DX2,沉默AIMP2-DX2基因引發(fā)MMP-2及MMP-9基因的表達下調(diào)。(4)沉默AIMP2-DX2可抑制CNE-1細胞的遷移和侵襲,可抑制CNE-1細胞的裸鼠模型中的成瘤生長。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.63

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本文編號：1574230