本文選題：結(jié)直腸癌　切入點(diǎn)：轉(zhuǎn)化生長因子βⅡ型受體　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：結(jié)直腸癌(CRC)在我國的發(fā)病率和致死率呈不斷上升趨勢。包括免疫治療在內(nèi)的綜合治療在結(jié)直腸癌治療中起到越來越重要的作用。通過多種方式用腫瘤抗原刺激自體淋巴細(xì)胞獲得抗原特異性殺傷細(xì)胞的研究眾多,腫瘤細(xì)胞表面的抗原被抗原提呈細(xì)胞(APC)加工成抗原肽與主要組織相容復(fù)合物(MHC)分子形成復(fù)合物提呈給T細(xì)胞并誘導(dǎo)其活化,形成腫瘤抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。轉(zhuǎn)化生長因子βII型受體(TGFβRⅡ)和O位N-乙酰葡萄糖胺糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)基因的框移突變產(chǎn)生的兩種新生抗原具有HLA-A2限制性,存在于20-40%的HLA-A2限制性結(jié)直腸癌患者且不存在于正常人和其他腫瘤患者,提呈后的抗原肽分別為TGFβRⅡ (RLSSCVPVA,131-139)和OGT (SLYKFSPFPL,28-37).腫瘤為了逃避識(shí)別,下調(diào)甚至不表達(dá)MHC分子,部分腫瘤患者免疫細(xì)胞數(shù)下降功能低下都會(huì)造成腫瘤抗原無法提呈,導(dǎo)致T細(xì)胞無法活化。針對上述T細(xì)胞無法活化的現(xiàn)狀,我們?nèi)斯ず铣煽乖牟⑴c患者的外周血T細(xì)胞共培養(yǎng),以提高結(jié)腸癌特異性T細(xì)胞的活化效率。接下來,用樹突狀細(xì)胞(DC)結(jié)合抗原肽誘導(dǎo)活化殺傷性T細(xì)胞與抗原肽直接刺激活化細(xì)胞比較殺傷效能,以期獲得同等或者更好的殺傷效果且減少體外對細(xì)胞操作,降低副反應(yīng)發(fā)生率。綜上所述,本課題旨在構(gòu)建簡便有效的腫瘤特異性T細(xì)胞的制備方法,以達(dá)到增強(qiáng)特異性同時(shí)降低更加安全的目的。方法：合成TGFβRⅡ (RLSSCVPVA,131-139)和OGT (SLYKFSPFPL,28-37)兩段抗原肽,質(zhì)譜分析進(jìn)行純度鑒定；篩選獲得表達(dá)TGFβRⅡ (RLSSCVPVA,131-139)和OGT(SLYKFSPFPL,28-37)且具有HLA-A2限制性的結(jié)腸癌細(xì)胞系一株：DLD-1。選擇具有HLA-A2限制性的結(jié)直腸癌患者,應(yīng)用密度梯度離心法和細(xì)胞因子刺激方式分離外周血培養(yǎng)獲得結(jié)直腸癌患者CD8+T細(xì)胞為主的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)昆懸液,流式細(xì)胞分析鑒定刺激培養(yǎng)前后細(xì)胞表型及比例；使用抗原肽與CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)刺激活化產(chǎn)生抗原特異性CTL, MTS實(shí)驗(yàn)測定針對DLD-1結(jié)腸癌細(xì)胞系不同效靶比的殺傷效應(yīng),ELISA方法評(píng)估了各組IFN-□分泌情況以進(jìn)一步評(píng)估CTL活化和殺傷能力。其次,表達(dá)HLA-A2分子健康人的PBMC誘導(dǎo)獲到成熟DC附載抗原肽刺激相應(yīng)個(gè)體T細(xì)胞活化形成抗原特異性CTL,比較DC疫苗誘導(dǎo)的CTL與直接使用抗原肽刺激的CTL殺傷活性。結(jié)果：我們獲得的TGFβRⅡ (RLSSCVPVA,131-139)和OGT (SLYKFSPFPL,28-37)抗原肽,純度≥99%,分別加入到表達(dá)HLAA2分子的結(jié)直腸癌患者和健康人PBMC,DC進(jìn)而誘導(dǎo)形成的抗原肽特異性CTL,經(jīng)MTS試驗(yàn)證實(shí)經(jīng)抗原肽刺激2的結(jié)直腸癌患者T細(xì)胞混懸液在第殺傷實(shí)驗(yàn)3天效靶比為5/1,10/1,20/1分別獲得對DLD-1的48.54%,63.62%和70.23%殺傷率,低于健康對照組的殺傷率為66.32%,74.82%和81.61%,僅在10/1條件下無抗原肽處理患者組的殺傷能力優(yōu)于健康對照,說明抗原肽刺激無法提高結(jié)腸癌患者自體免疫細(xì)胞殺傷DLD-1的能力。另外,與DC細(xì)胞負(fù)載抗原肽誘導(dǎo)形成的腫瘤抗原肽特異性CTL相比,直接使用抗原肽刺激正常人的T細(xì)胞為主的PBMC誘導(dǎo)得到的特異性CTL能夠?qū)LD-1獲得更好的殺傷效果：與DC負(fù)載抗原肽誘導(dǎo)形成的腫瘤抗原肽特異性CTL相比,直接刺激獲得的特異性CTL第14天在效靶比為5/1時(shí),DC負(fù)載抗原肽1(OGT)與抗原肽1直接刺激獲得的CTL對DLD-1的殺傷率分別為26.71%和65.84%(P=0.054),DC負(fù)載與抗原肽2(TGFβRⅡ)直接刺激的CTL對DLD-1的殺傷率分別為20.69%和81.32%(P=0.039),DC負(fù)載與抗原肽1+2直接刺激的CTL對DLD-1的殺傷率分別為39.91%和69.24%(P=0.048)。在效靶比為10/1時(shí),DC負(fù)載與抗原肽1直接刺激的CTL對DLD-1的殺傷率分別為36.33%和88.82%(P=0.038),DC負(fù)載與抗原肽2直接刺激的CTL對DLD-1的殺傷率分別為37.51%和89.74%(P=0.022),DC負(fù)載與抗原肽1+2直接刺激的CTL對DLD-1的殺傷率分別為45.58%和86.61%(P=0.043)。結(jié)論：本研究合成的兩種結(jié)直腸癌新生抗原肽直接負(fù)載在健康人細(xì)胞中能獲得對DLD-1較高的殺傷效果。兩種抗原肽可能成為未來作為結(jié)腸癌免疫治療的新靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34
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本文編號(hào)：1570168