本文選題：多發(fā)性骨髓瘤　切入點(diǎn)：Bruton’s酪氨酸激酶　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：背景及目的:多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種惡性漿細(xì)胞增殖性疾病,是常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一。雖然近年來(lái)對(duì)其治療取得了一定進(jìn)展,如蛋白酶體抑制劑硼替佐米(bortezomib)的應(yīng)用極大提高了治療的總反應(yīng)率,延長(zhǎng)了患者生存期,但MM仍不可治愈,復(fù)發(fā)率高。除初治不敏感的患者外,有近一半的初治敏感患者復(fù)發(fā)后對(duì)硼替佐米治療的反應(yīng)性降低,因此尋找新的治療藥物、探索新的聯(lián)合用藥方案是進(jìn)一步提高M(jìn)M療效和預(yù)后的關(guān)鍵。Bruton’t酪氨酸激酶(Bruton’t tyrosine kinase,BTK)是一種胞漿酪氨酸蛋白激酶,主要表達(dá)于各分化階段的B細(xì)胞,是B細(xì)胞抗原識(shí)別受體(B-cell antigen receptor,BCR)信號(hào)通路的重要組分,對(duì)正常B細(xì)胞的分化、發(fā)育和功能有重要影響。近年的研究表明,BTK在多種B細(xì)胞性惡性腫瘤(如慢性淋巴細(xì)胞白血病、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤)中的表達(dá)及活性增高,增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。ibrutinib是針對(duì)BTK的選擇性抑制劑,可與BTK活性位點(diǎn)的半胱氨酸殘基(Cys-481)共價(jià)結(jié)合,并抑制其磷酸化激活,從而不可逆地抑制其激酶活性,對(duì)BTK的半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration,IC50)為0.5 nmol/L,目前已在慢性淋巴細(xì)胞白血病、套細(xì)胞淋巴瘤、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中顯示了有效的體內(nèi)外抗腫瘤活性。AVL-292(CC-292)是另一種新型的選擇性BTK抑制劑,其作用機(jī)制與ibrutinib相似,但對(duì)BTK的IC500.5 nmol/L。漿細(xì)胞是終末分化階段的B細(xì)胞,正常漿細(xì)胞中BTK表達(dá)量極低甚至無(wú)表達(dá),但最近多個(gè)研究小組先后在MM患者腫瘤細(xì)胞和某些MM細(xì)胞系中檢測(cè)出了BTK的表達(dá)。目前有關(guān)BTK抑制劑ibrutinib和AVL-292在MM中的研究報(bào)道尚少。本研究旨在通過(guò)觀察、比較兩種BTK抑制劑ibrutinib和AVL-292對(duì)MM細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及與臨床常用蛋白酶體抑制劑硼替佐米的聯(lián)合效應(yīng),并探討其可能的效應(yīng)機(jī)制,來(lái)明確BTK抑制劑在骨髓瘤治療中的應(yīng)用價(jià)值,以期為MM治療提供新的靶點(diǎn)和聯(lián)合用藥方案。方法:1、采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系NCIH929、RPMI8226細(xì)胞中BTK蛋白表達(dá)情況。不同濃度ibrutinib、AVL-292單藥以及兩藥分別聯(lián)合硼替佐米處理NCI-H929、RPMI8226細(xì)胞,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖,Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blot法檢測(cè)藥物處理前后細(xì)胞內(nèi)BTK、NF-κB(p65)、AKT、ERK蛋白及其磷酸化水平,以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xL、cleaved(活化型)caspase-3的表達(dá)水平。2、密度梯度離心法分離MM患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞,體外貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymalstemcells,bmscs),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定第3代bmscs免疫表型;用成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)bmscs,然后分別用茜素紅、阿利新藍(lán)、油紅o染色法檢測(cè)培養(yǎng)獲得的患者bmscs的成骨、成軟骨、成脂特性。3、用ibrutinib、avl-292分別處理患者bmscs,cck-8法檢測(cè)ibrutinib和avl-292對(duì)bmscs增殖的影響,熒光定量rt-pcr法檢測(cè)ibrutinib和avl-292對(duì)bmscs中白介素-6(il-6)基因mrna表達(dá)水平的影響。建立mm細(xì)胞與bmscs共培養(yǎng)體系,cck-8法檢測(cè)mm患者bmscs對(duì)mm細(xì)胞系增殖的影響以及ibrutinib、avl-292對(duì)共培養(yǎng)體系中nci-h929細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:1、nci-h929、rpmi8226細(xì)胞中存在btk蛋白表達(dá)。2、ibrutinib和avl-292均可抑制nci-h929、rpmi8226細(xì)胞增殖,其抑制作用呈濃度依賴(lài)性。在nci-h929細(xì)胞,當(dāng)ibrutinib濃度為10、50、100μmol/l,avl-292濃度為5、10、50、100μmol/l時(shí),24h細(xì)胞活性與48h細(xì)胞活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05,p0.01),呈現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性。ibrutinib對(duì)nci-h929、rpmi8226細(xì)胞48h的ic50分別為(10.41±3.29)μmol/l、(51.65±13.58)μmol/l;avl-292對(duì)nci-h929、rpmi8226細(xì)胞48h的ic50分別為(7.77±2.99)μmol/l、(6.44±1.06)μmol/l。3、不同濃度的ibrutinib(5、10μmol/l)和avl-292(5、10μmol/l)與不同濃度的硼替佐米(5、10、20、50nmol/l)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)nci-h929、rpmi8226細(xì)胞的增殖抑制率均高于相應(yīng)濃度單藥組(p0.05,p0.01),不同組合的協(xié)同系數(shù)r均大于1。4、10μmol/librutinib、10μmol/lavl-292和20nmol/l硼替佐米單獨(dú)作用48h后,nci-h929細(xì)胞的凋亡率分別為(16.47±2.70)%、(20.23±3.95)%和(12.40±1.06)%,均較對(duì)照組升高(p0.05,p0.01);rpmi8226細(xì)胞的凋亡率分別為(11.27±1.64)%、(17.50±3.70)%和(6.30±0.92)%,除硼替佐米外均較對(duì)照組升高(p0.05,p0.01);10μmol/librutinib和10μmol/lavl-292分別與20nmol/l硼替佐米聯(lián)合后,nci-h929細(xì)胞凋亡率分別為(32.20±2.74)%和(38.70±5.03)%,rpmi8226細(xì)胞凋亡率分別為(26.60±1.51)%和(35.93±3.11)%,均顯著高于相應(yīng)單藥組(p0.01)。5、10μmol/librutinib單藥和10μmol/lavl-292單藥作用24h后,nci-h929細(xì)胞內(nèi)btk、nf-κb(p65)、akt和erk的磷酸化水平和抗凋亡蛋白bcl-xl表達(dá)水平降低,cleaved(活化型)caspase-3表達(dá)水平增加;與硼替佐米聯(lián)合應(yīng)用,兩藥對(duì)上述蛋白的調(diào)節(jié)作用均增強(qiáng)。6、成功獲得mm患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mm-bmscs),流式免疫表型分析顯示mm-bmscs表達(dá)cd73、cd90和cd105,不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記cd34和cd45;并且經(jīng)誘導(dǎo)后,bmscs可以向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞方向分化,具有間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)的特性。7、10μmol/librutinib和10μmol/lavl-292處理48h后,初發(fā)/進(jìn)展期和穩(wěn)定期患者來(lái)源的bmscs的增殖活性較對(duì)照組無(wú)明顯變化(P0.05),但初發(fā)/進(jìn)展期BMSCs中IL-6 mRNA水平較對(duì)照組降低(P0.01)。8、NCI-H929、RPMI8226細(xì)胞與初發(fā)/進(jìn)展期BMSCs共培養(yǎng)48 h后,細(xì)胞增殖活性較各自單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)升高(P0.01);與穩(wěn)定期BMSCs共培養(yǎng)后,細(xì)胞增殖活性與各自單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)無(wú)明顯差異(P0.05)。9、ibrutinib和AVL-292均能抑制與初發(fā)/進(jìn)展期BMSCs共培養(yǎng)的NCI-H929細(xì)胞的增殖,10μmol/L ibrutinib和10μmol/L AVL-292能完全阻斷BMSCs對(duì)NCI-H929細(xì)胞的促增殖作用。結(jié)論:1、BTK抑制劑ibrutinib和AVL-292對(duì)存在BTK表達(dá)的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系NCI-H929、RPMI8226有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用,并與蛋白酶體抑制劑硼替佐米有協(xié)同作用,其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞內(nèi)BTK激酶活性及下游NF-κB、AKT、ERK信號(hào)通路活性、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL表達(dá)、激活caspase-3依賴(lài)的凋亡途徑有關(guān)。2、Ibrutinib和AVL-292能夠抑制與初發(fā)/進(jìn)展期患者BMSCs共培養(yǎng)的NCIH929細(xì)胞的增殖,阻斷BMSCs對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖的刺激作用;還能抑制初發(fā)/進(jìn)展期患者BMSCs中IL-6基因mRNA的表達(dá),但對(duì)BMSCs的增殖活性無(wú)明顯影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R733.3
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本文編號(hào)：1569283