本文選題：多發(fā)性骨髓瘤　切入點：Bruton’s酪氨酸激酶　出處：《第二軍醫(yī)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景及目的:多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種惡性漿細胞增殖性疾病,是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一。雖然近年來對其治療取得了一定進展,如蛋白酶體抑制劑硼替佐米(bortezomib)的應用極大提高了治療的總反應率,延長了患者生存期,但MM仍不可治愈,復發(fā)率高。除初治不敏感的患者外,有近一半的初治敏感患者復發(fā)后對硼替佐米治療的反應性降低,因此尋找新的治療藥物、探索新的聯(lián)合用藥方案是進一步提高MM療效和預后的關鍵。Bruton’t酪氨酸激酶(Bruton’t tyrosine kinase,BTK)是一種胞漿酪氨酸蛋白激酶,主要表達于各分化階段的B細胞,是B細胞抗原識別受體(B-cell antigen receptor,BCR)信號通路的重要組分,對正常B細胞的分化、發(fā)育和功能有重要影響。近年的研究表明,BTK在多種B細胞性惡性腫瘤(如慢性淋巴細胞白血病、彌漫大B細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤)中的表達及活性增高,增強了腫瘤細胞的存活和增殖。ibrutinib是針對BTK的選擇性抑制劑,可與BTK活性位點的半胱氨酸殘基(Cys-481)共價結合,并抑制其磷酸化激活,從而不可逆地抑制其激酶活性,對BTK的半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration,IC50)為0.5 nmol/L,目前已在慢性淋巴細胞白血病、套細胞淋巴瘤、彌漫大B細胞淋巴瘤中顯示了有效的體內外抗腫瘤活性。AVL-292(CC-292)是另一種新型的選擇性BTK抑制劑,其作用機制與ibrutinib相似,但對BTK的IC500.5 nmol/L。漿細胞是終末分化階段的B細胞,正常漿細胞中BTK表達量極低甚至無表達,但最近多個研究小組先后在MM患者腫瘤細胞和某些MM細胞系中檢測出了BTK的表達。目前有關BTK抑制劑ibrutinib和AVL-292在MM中的研究報道尚少。本研究旨在通過觀察、比較兩種BTK抑制劑ibrutinib和AVL-292對MM細胞增殖、凋亡的影響以及與臨床常用蛋白酶體抑制劑硼替佐米的聯(lián)合效應,并探討其可能的效應機制,來明確BTK抑制劑在骨髓瘤治療中的應用價值,以期為MM治療提供新的靶點和聯(lián)合用藥方案。方法:1、采用蛋白質印跡(Western blot)法檢測人多發(fā)性骨髓瘤細胞系NCIH929、RPMI8226細胞中BTK蛋白表達情況。不同濃度ibrutinib、AVL-292單藥以及兩藥分別聯(lián)合硼替佐米處理NCI-H929、RPMI8226細胞,采用CCK-8法檢測細胞增殖,Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡,Western blot法檢測藥物處理前后細胞內BTK、NF-κB(p65)、AKT、ERK蛋白及其磷酸化水平,以及凋亡相關蛋白Bcl-xL、cleaved(活化型)caspase-3的表達水平。2、密度梯度離心法分離MM患者骨髓單個核細胞,體外貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymalstemcells,bmscs),應用流式細胞術鑒定第3代bmscs免疫表型;用成骨、成軟骨、成脂誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)bmscs,然后分別用茜素紅、阿利新藍、油紅o染色法檢測培養(yǎng)獲得的患者bmscs的成骨、成軟骨、成脂特性。3、用ibrutinib、avl-292分別處理患者bmscs,cck-8法檢測ibrutinib和avl-292對bmscs增殖的影響,熒光定量rt-pcr法檢測ibrutinib和avl-292對bmscs中白介素-6(il-6)基因mrna表達水平的影響。建立mm細胞與bmscs共培養(yǎng)體系,cck-8法檢測mm患者bmscs對mm細胞系增殖的影響以及ibrutinib、avl-292對共培養(yǎng)體系中nci-h929細胞增殖的影響。結果:1、nci-h929、rpmi8226細胞中存在btk蛋白表達。2、ibrutinib和avl-292均可抑制nci-h929、rpmi8226細胞增殖,其抑制作用呈濃度依賴性。在nci-h929細胞,當ibrutinib濃度為10、50、100μmol/l,avl-292濃度為5、10、50、100μmol/l時,24h細胞活性與48h細胞活性差異有統(tǒng)計學意義(p0.05,p0.01),呈現(xiàn)出時間依賴性。ibrutinib對nci-h929、rpmi8226細胞48h的ic50分別為(10.41±3.29)μmol/l、(51.65±13.58)μmol/l;avl-292對nci-h929、rpmi8226細胞48h的ic50分別為(7.77±2.99)μmol/l、(6.44±1.06)μmol/l。3、不同濃度的ibrutinib(5、10μmol/l)和avl-292(5、10μmol/l)與不同濃度的硼替佐米(5、10、20、50nmol/l)聯(lián)合應用對nci-h929、rpmi8226細胞的增殖抑制率均高于相應濃度單藥組(p0.05,p0.01),不同組合的協(xié)同系數(shù)r均大于1。4、10μmol/librutinib、10μmol/lavl-292和20nmol/l硼替佐米單獨作用48h后,nci-h929細胞的凋亡率分別為(16.47±2.70)%、(20.23±3.95)%和(12.40±1.06)%,均較對照組升高(p0.05,p0.01);rpmi8226細胞的凋亡率分別為(11.27±1.64)%、(17.50±3.70)%和(6.30±0.92)%,除硼替佐米外均較對照組升高(p0.05,p0.01);10μmol/librutinib和10μmol/lavl-292分別與20nmol/l硼替佐米聯(lián)合后,nci-h929細胞凋亡率分別為(32.20±2.74)%和(38.70±5.03)%,rpmi8226細胞凋亡率分別為(26.60±1.51)%和(35.93±3.11)%,均顯著高于相應單藥組(p0.01)。5、10μmol/librutinib單藥和10μmol/lavl-292單藥作用24h后,nci-h929細胞內btk、nf-κb(p65)、akt和erk的磷酸化水平和抗凋亡蛋白bcl-xl表達水平降低,cleaved(活化型)caspase-3表達水平增加;與硼替佐米聯(lián)合應用,兩藥對上述蛋白的調節(jié)作用均增強。6、成功獲得mm患者骨髓間充質干細胞(mm-bmscs),流式免疫表型分析顯示mm-bmscs表達cd73、cd90和cd105,不表達造血細胞標記cd34和cd45;并且經(jīng)誘導后,bmscs可以向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞方向分化,具有間充質干細胞(mscs)的特性。7、10μmol/librutinib和10μmol/lavl-292處理48h后,初發(fā)/進展期和穩(wěn)定期患者來源的bmscs的增殖活性較對照組無明顯變化(P0.05),但初發(fā)/進展期BMSCs中IL-6 mRNA水平較對照組降低(P0.01)。8、NCI-H929、RPMI8226細胞與初發(fā)/進展期BMSCs共培養(yǎng)48 h后,細胞增殖活性較各自單獨培養(yǎng)時升高(P0.01);與穩(wěn)定期BMSCs共培養(yǎng)后,細胞增殖活性與各自單獨培養(yǎng)時無明顯差異(P0.05)。9、ibrutinib和AVL-292均能抑制與初發(fā)/進展期BMSCs共培養(yǎng)的NCI-H929細胞的增殖,10μmol/L ibrutinib和10μmol/L AVL-292能完全阻斷BMSCs對NCI-H929細胞的促增殖作用。結論:1、BTK抑制劑ibrutinib和AVL-292對存在BTK表達的多發(fā)性骨髓瘤細胞系NCI-H929、RPMI8226有增殖抑制和凋亡誘導作用,并與蛋白酶體抑制劑硼替佐米有協(xié)同作用,其機制可能與抑制細胞內BTK激酶活性及下游NF-κB、AKT、ERK信號通路活性、下調抗凋亡蛋白Bcl-xL表達、激活caspase-3依賴的凋亡途徑有關。2、Ibrutinib和AVL-292能夠抑制與初發(fā)/進展期患者BMSCs共培養(yǎng)的NCIH929細胞的增殖,阻斷BMSCs對骨髓瘤細胞增殖的刺激作用;還能抑制初發(fā)/進展期患者BMSCs中IL-6基因mRNA的表達,但對BMSCs的增殖活性無明顯影響。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R733.3
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本文編號：1569283