本文選題：miR-424-5p　切入點(diǎn)：NSCLC　出處：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是一類小的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA,主要通過(guò)與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)配對(duì)來(lái)降解靶基因mRNA或抑制其表達(dá),實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控。近年來(lái),microRNAs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用使其逐漸成為腫瘤檢測(cè)標(biāo)記和癌癥治療潛在靶標(biāo)而受到廣泛研究。MiR-424-5p被報(bào)道在多種腫瘤中異常調(diào)節(jié),但是其在人類非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的作用和分子機(jī)制研究還有待明確。本文主要研究了 miR-424-5p在NSCLC細(xì)胞A549中的作用及其相關(guān)分子機(jī)制。1、miR-424-5p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)肺癌細(xì)胞A549的影響本研究首先利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測(cè)miR-424-5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460中的表達(dá)。結(jié)果表明,與正常支氣管上皮細(xì)胞HBE相比,miR-424-5p在A549中的表達(dá)明顯升高,而在H460細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)顯著差異,因此本實(shí)驗(yàn)選擇A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。其次,設(shè)計(jì)合成miR-424-5p的抑制物(miR-424-5p inhibitor),利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞中,通過(guò)轉(zhuǎn)染熒光對(duì)照確定最適轉(zhuǎn)染濃度,根據(jù)轉(zhuǎn)染24h后的熒光強(qiáng)度選擇100 nM為miR-424-5p inhibitor的最佳轉(zhuǎn)染濃度。最后,利用RT-qPCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-424-5p inhibitor后對(duì)miR-424-5p表達(dá)的抑制效率,結(jié)果顯示miR-424-5p的表達(dá)水平降低了 34.74%(P0.05)。本研究同時(shí)檢測(cè)了 miR-424-5p對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性表型的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制miR-424-5p后,A549細(xì)胞的增殖受到明顯抑制(P0.05),平板克隆實(shí)驗(yàn)表明抑制miR-424-5p后,A549細(xì)胞克隆形成數(shù)與對(duì)照組相比下降了52.11%(P0.05),流式分析結(jié)果表明抑制miR-424-5p后,A549細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加,約為對(duì)照組的5倍。利用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移,結(jié)果表明抑制miR-424-5p后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞劃痕愈合能力減弱,A549細(xì)胞遷移率下降了 39.43%(P0.01),Transwell實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明A549細(xì)胞的侵襲受到明顯抑制,約為對(duì)照組的37.60%(P0.01)。2、miR-424-5p與靶基因CLOCK之間的相互作用為了研究miR-424-5p的作用途徑,通過(guò)Targetscan等軟件在線預(yù)測(cè)了miR-424-5p的靶基因,候選基因?yàn)锳SH1L、CLOCK、RICTOR、WEE1、PPPP1R11、PDCD4、SOCS6和SUZ12。利用RT-qPCR方法檢測(cè)了這些基因在HBE、A549及轉(zhuǎn)染miR-424-5p后A549細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果表明,ASH1L、CLOCK、PPPP1R11和PDCD4在A549細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(HBE)(P0.01),而在抑制miR-424-5p后的A549細(xì)胞中這些基因的表達(dá)明顯升高(P0.01)。隨后,利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證ASH1L、CLOCK、PPPP1R11和PDCD4是否為miR-424-5p的靶基因,結(jié)果表明CLOCK基因?yàn)閙iR-424-5p的一個(gè)靶基因。Western Blot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-424-5p inhibitor后CLOCK蛋白表達(dá)明顯升高(P0.01),這與mRNA的表達(dá)變化相一致,進(jìn)一步證明CLOCK基因?yàn)閙iR-424-5p的靶基因。為了進(jìn)一步分析miR-424-5p和CLOCK基因的相互作用關(guān)系,本研究利用基因編輯技術(shù)在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CLOCK基因。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)CLOCK后miR-424-5p的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異,但是顯著抑制了A549細(xì)胞的增殖、遷移和克隆形成能力。綜上所述,miR-424-5p在肺癌細(xì)胞A549中高表達(dá),抑制miR-424-5p的表達(dá)后,可降低A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。確定CLOCK是miR-424-5p的一個(gè)靶基因,抑制miR-424-5p表達(dá)后CLOCK的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)明顯升高,而CLOCK基因的過(guò)表達(dá)雖然不影響miR-424-5p的表達(dá),但顯著抑制了細(xì)胞惡性表型。因此,miR-424-5p可能是通過(guò)調(diào)節(jié)CLOCK基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1567674